油酸或α-亚麻酸对葡萄酒酵母发酵活力和香气的影响

刘沛通 段长青 燕国梁*

（1 葡萄与葡萄酒研究中心 中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京100083 2 农业部葡萄酒加工重点实验室 北京100083）

不饱和脂肪酸是酿酒酵母生长代谢的必需营养物质， 对酵母繁殖及葡萄酒发酵香气物质的产生具有重要影响[1-2]。 葡萄汁是酿酒酵母利用不饱和脂肪酸的主要来源，其中油酸、亚油酸和α-亚麻酸是葡萄汁中的主要不饱和脂肪酸， 其浓度和种类变化直接影响酵母的生长及发酵性能[3-6]。 葡萄汁中的不饱和脂肪酸被酵母迅速吸收整合入细胞膜中，改善酵母细胞膜的流动性和完整性，提高酵母的抗逆性， 促进酵母与环境基质中的物质交换，影响酵母生长繁殖[7-9]。细胞膜功能的改善影响膜转运基因的表达， 添加不饱和脂肪酸可上调氨基酸转运基因，增加胞内氨基酸的积累；氨基酸是高级醇类化合物的重要前体物质， 其含量的变化直接影响高级醇及其乙酸酯类物质的生成[6]。 同时，部分不饱和脂肪酸进入酵母细胞内部，通过调节香气前体物质以及相关基因表达来影响香气化合物（包括中链脂肪酸及其乙酯）的生成[3，10-11]。 高级醇、 酸类和酯类物质浓度的变化共同影响葡萄酒的感官品质。

近年来， 大量研究关注葡萄汁中不饱和脂肪酸的浓度及种类的变化对葡萄酒发酵及香气的作用。 Pinu 等[12]报道增加亚油酸的浓度抑制了硫化物的产生。 Casu 等[2]研究表明添加亚油酸促进高级醇的合成，降低乙酸酯类物质的含量，影响葡萄酒的风味和口感。 复合添加油酸、亚油酸和α-亚麻酸也会促进酵母生长代谢， 提高葡萄酒中高级醇和乙酯类物质的含量， 调控葡萄酒香气品质[1]。目前的研究主要集中在复合脂类或亚油酸含量变化对酵母发酵的影响，而油酸和α-亚麻酸浓度变化对酵母发酵性能及香气物质浓度的影响仍需探明。 葡萄汁中油酸和α-亚麻酸的含量分别占不饱和脂肪酸总量的10%和13%左右， 仅次于葡萄汁中的亚油酸含量[1]。 油酸和α-亚麻酸的浓度受栽培处理和酿造工艺的影响显著， 如葡萄果实的曝光处理可使油酸和α-亚麻酸含量由微量分别增加至117 mg/L 和132 mg/L[1]，而浸渍工艺可将葡萄汁中的油酸和α-亚麻酸浓度分别增加1 至2倍[13]。从实际生产的角度，研究油酸和α-亚麻酸的浓度变化对酵母生长代谢和葡萄酒香气的影响是很有必要的。 本试验以“赤霞珠”葡萄汁为发酵基质，参考文献[6]，分别添加3 个浓度的油酸或α-亚麻酸，比较不同浓度下油酸或α-亚麻酸对酵母生长、主要代谢产物以及香气物质生成的影响，旨在进一步提高葡萄酒的感官品质。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器、设备

葡萄汁：使用2014年采收于河北昌黎的“赤霞珠”（Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon）葡萄果实，除梗、破碎后出汁，其还原糖239 g/L，可滴定酸（以酒石酸计）5.9 g/L，pH 3.3，油酸0.13 mg/L，亚麻酸0.12 mg/L。

菌株： 商业酿酒酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae var. bayanus）EC1118， 法国Lallemand公司。

试验仪器：Agilent 1200 series HPLC 系统，美国Agilent 公司；Agilent 7890N/5975B MS 型 气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司；离子交换色谱柱HPX-87H Aminex ion-exchange column（300 mm×7.8 mm）， 美国Bio-Rad Laboratories；毛细管色谱柱HP-INNOWAX 60 m × 0.25 mm ×0.25 μm，美国J & W Scientific 公司；示差折光检测器 （RID，refractive index detector，G1362A），美国Agilent 公司； 二极管阵列检测器（DAD，photodiode array detector，G1315D），美国Agilent 公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS fiber 萃取柱， 美国Supelco 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵条件 发酵前分别向葡萄汁中添加3个质量浓度（12，60，120 mg/L）的油酸或α-亚麻酸， 编号分别为OA-12，OA-60，OA-120，ALA-12，ALA-60，ALA-120。 在500 mL 锥形瓶中发酵，每瓶装入350 mL 葡萄汁，商业酵母活化后接入葡萄汁中，液封发酵栓，密封瓶口，25 ℃下静置发酵。所有处理设置3 次生物学重复。

发酵早期每12 h 测定1 次酵母细胞生长情况（OD600nm）和还原糖浓度，进入稳定期后每24 h测定1 次， 监测酵母的生长发酵情况。 发酵结束后，低温（4 ℃）离心（8 000 r/min，10 min）后弃菌体，上清液于-20 ℃下冻藏，用于代谢产物的测定。

1.2.2 发酵产物的测定 葡萄糖、果糖、甘油、乙醇和有机酸（乙酸、苹果酸、柠檬酸和乳酸）的测定参考Liu 等[14]的方法。5 mmol/L H2SO4溶液为流动相，以流速0.6 mL/min 等度洗脱。葡萄糖、果糖、甘油和乙醇的测定用示差折光检测器， 柱温45 ℃，进样量20 μL。 有机酸的测定使用二极管阵列检测器， 检测波长214 nm， 柱温60 ℃， 进样量10 μL。

挥发性香气物质的检测参考Lan 等[15]的方法，使用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）进行。将5 mL 样品加入15 mL 样品瓶中，加入1 g NaCl、10 μL 内标（4-甲基-2-戊醇）后迅速用带有隔垫的瓶盖拧紧密封， 使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS fiber 在40 °C 恒温条件下180 r/min 萃 取30 min 后， 用Agilent 7890A-5975C 气相色谱-质谱联用仪检测。 使用HP-INNOWAX 60 m × 0.25 mm × 0.25 μm 毛细管色谱柱，柱温50 ℃保持1 min，之后以3°C/min 的速率升至220 ℃保持5 min。 载气为高纯氦气 （纯度99.999%），流速1.0 mL/min。 电子轰击电离源（EI）方式，离子源能量为70 eV，质量扫描范围30～350 m/z。 所有检测均做3 次技术重复。

使用质谱全离子扫描（Scan）图谱，根据本实验室建立的相同检测条件下各化合物的保留时间、保留指数和质谱信息进行定性分析。使用各化合物在模拟酒溶液（2 g/L 葡萄糖、12%酒精度和7 g/L 酒石酸的水溶液）中的标准曲线定量。

1.2.3 统计分析和作图 使用SPSS 20.0 单因素方差分析（ANOVA）对处理间各代谢产物含量差异显著性进行分析， 采用Duncan 检验两两比较，显著性水平P＜0.05。 图形采用Origin 9.0 绘制。

2 结果与讨论

2.1 油酸或α-亚麻酸对酵母生长和发酵速率的影响

如图1 所示，从对数中期开始，添加不饱和脂肪酸（油酸或α-亚麻酸）显著提高酵母的细胞量，其中12 mg/L 油酸（OA-12）和α-亚麻酸添加组（ALA-12）中酵母的最大OD 值分别为7.69 和7.83，均显著高于对照组（7.09）。 同时，油酸或α-亚麻酸可显著促进葡萄汁中还原糖的消耗， 提高酵母的发酵速率，12 mg/L α-亚麻酸添加组（ALA-12）的还原糖消耗速率最大（1.80 g/L/h），显著高于对照组（1.68 g/L/h）。

2.2 油酸或α-亚麻酸对发酵主产物的影响

酒精发酵结束后，酒中残糖量、甘油、乙醇和乙酸、苹果酸、柠檬酸和乳酸的含量如表1 所示。与对照组相比，添加油酸或α-亚麻酸后，残糖浓度随不饱和脂肪酸浓度的增加呈先降低后增加的趋势，其中添加12 mg/L α-亚麻酸（ALA-12）显著降低葡萄酒中的残糖浓度。 添加不饱和脂肪酸可以促进糖的消耗，然而不饱和脂肪酸浓度过高时，其对酵母生长代谢的促进作用减弱（图1），导致酵母的糖利用率降低，残糖浓度增加。葡萄酒中的乙醇含量随油酸和α-亚麻酸浓度的增加而升高。与对照相比，添加油酸和α-亚麻酸各组葡萄酒中的甘油含量有所增加， 增强葡萄酒的圆润感[16]。所有处理葡萄酒中的乙酸含量均在0.2～0.7 g/L 范围， 含量适中的乙酸可为葡萄酒带来愉悦的香气[11]。 与对照相比，添加油酸和α-亚麻酸组葡萄酒中苹果酸的含量有所降低， 柠檬酸和乳酸含量并无显著差异。

图1 不同浓度油酸（a）或α-亚麻酸（b）对酵母生长和还原糖消耗的影响Fig.1 Effects of different concentrations of oleic acid （a）or α-linolenic acid （b）on yeast growth and sugar consumption

表1 添加不同质量浓度油酸或α-亚麻酸对酒精发酵结束葡萄酒成分的影响Table 1 Effects of adding different concentrations of oleic acid or α-linolenic acid on the profile of final wines

2.3 油酸或α-亚麻酸对葡萄酒香气的影响

酒精发酵结束后，从葡萄酒中共检测到21 种挥发性香气物质，包括7 种醇类、4 种乙酸酯类、5种乙酯类、4 种酸类物质以及1 种含硫化合物。 其中，异丁醇、异戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯等14 种物质在酒中含量超过其感觉阈值， 其香气值（Odour Active Value，OAV）大于1（表2）。

油酸和α-亚麻酸的浓度变化对香气化合物影响显著。异丁醇、异戊醇和苯乙醇是本研究中检测出的主要高级醇，添加油酸或α-亚麻酸可提高葡萄酒中高级醇的含量（表2）。 葡萄酒中乙酸乙酯、 乙酸异戊酯和乙酸己酯等乙酸酯类物质的含量在添加油酸或α-亚麻酸后也有提高， 其中12 mg/L 的α-亚麻酸（ALA-12）显著促进这3 种物质的合成， 其含量与对照相比分别提高了52.27%，27.16%和31.33%，最终导致乙酸酯类物质与对照相比增产49.27%，为葡萄酒带来果香、花香等愉悦香气（表2）。 添加油酸或α-亚麻酸促进了酸类物质（包括己酸、辛酸、癸酸和异戊酸）的产生，其中12 mg/L α-亚麻酸添加组（ALA-12）葡萄酒中辛酸含量最高，比对照提高31.51%；60 mg/L 油酸（OA-60）添加组葡萄酒中异戊酸含量较对照提高53.01%（表2）。 与酸类物质变化相似，添加油酸或α-亚麻酸促进葡萄酒中乙酯类物质的生成， 其中12 mg/L α-亚麻酸添加组（ALA-12）中乙酯类物质总量较对照提高32.41%（表2）。 3-甲硫基丙醇是检测出的唯一含硫化合物， 其含量过高时会给葡萄酒带来脂肪味。 添加油酸显著增加了葡萄酒中该物质含量，然而α-亚麻酸添加组与对照酒样相比并无显著性差异（表2）。

以上结果表明，增加葡萄汁中油酸或α-亚麻酸浓度可显著改变葡萄酒中香气物质的含量，主要表现为促进葡萄酒中高级醇、 酸类和酯类物质的生成，影响葡萄酒的香气特征。

2.4 油酸或α-亚麻酸发酵葡萄酒的香气轮廓

添加不同浓度油酸和α-亚麻酸对葡萄酒香气特征的影响直接改变葡萄酒的香气轮廓。 将葡萄酒中OAV 大于1 的14 种物质进行香气系列归类，参考文献[17]，根据各物质的香气特征分为5大类，分别为花香、果香、焦糖味、溶剂味和脂肪味（图2）。 果香和花香特征在所有葡萄酒中都比较突出，其次为溶剂味、焦糖味和脂肪味。整体来看，与添加油酸相比，添加α-亚麻酸更有利于提升葡萄酒的果香和花香特征， 特别是添加12 mg/L 的α-亚麻酸（ALA-12），可显著改善葡萄酒的香气特性。

3 讨论

油酸和α-亚麻酸可通过调节酵母的生长代谢来影响葡萄酒的香气。厌氧发酵时，不饱和脂肪酸为酵母生长提供必需营养物质， 葡萄汁中其含量的提高可显著促进酵母的生长繁殖和发酵速度[1]。 本研究中，添加油酸或α-亚麻酸可显著提高酵母的细胞量， 促进葡萄汁中还原糖的消耗（图1）。 值得注意的是， 添加12 mg/L 的α-亚麻酸（ALA-12）具有较显著的促进作用（图1）。 酿酒酵母自身不能合成α-亚麻酸，厌氧发酵条件下适当浓度的α-亚麻酸不仅可以保持酵母细胞膜的完整性，增强酵母的抗逆能力，也可以参与酵母生长代谢，有利于酵母的生长发酵[6-7，9]。

图2 添加不同浓度油酸或α-亚麻酸对葡萄酒香气活性值的影响Fig.2 Effects of adding different concentrations of oleic acid or α-linolenic acid on OAVs of final wines

葡萄汁中的不饱和脂肪酸部分被酵母吸收，参与香气化合物的代谢。 高级醇是葡萄酒重要的香气物质，主要由酿酒酵母通过Ehrlich 途径降解氨基酸生成[22]。 本研究中添加油酸或α-亚麻酸促进了高级醇的生成（表2）。 研究表明，不饱和脂肪酸浓度的升高可上调氨基酸转运酶基因GAP1 的表达水平，促进氨基酸向酵母细胞内的转运，增加高级醇前体物质氨基酸的浓度， 从而提高葡萄酒中高级醇的含量[1，23]。OA-12、OA-120 和ALA-120的高级醇含量高于400 mg/L， 给葡萄酒带来强烈的刺鼻味[11]。 综上，控制葡萄汁中不饱和脂肪酸的种类， 保持适当的不饱和脂肪酸浓度也是很有必要的。

短、中链脂肪酸（己酸、辛酸和癸酸）在低浓度时可产生清新的香气， 当其含量超过20 mg/L 时会产生不愉悦的酸腐味[24]。 与对照相比，添加油酸或α-亚麻酸显著提高了葡萄酒中短、中链脂肪酸的浓度（表2），且各组酸类物质总量未超过不良浓度范围，不仅提高了葡萄酒的香气品质，也对葡萄酒的香气复杂性有重要贡献[8，24-25]。

酯类物质包括乙酸酯类和乙酯类， 可为葡萄酒提供宜人的果香和花香， 对葡萄酒香气品质有积极贡献[11]。 添加油酸或α-亚麻酸可提高葡萄酒中乙酸酯类物质的含量， 其中以12 mg/L α-亚麻酸（ALA-12）的促进作用最为显著，为葡萄酒带来果香、花香等愉悦香气。 随着α-亚麻酸浓度的增加，其对乙酸酯类物质的促进作用逐渐降低。研究表明， 高浓度的不饱和脂肪酸会抑制乙酸酯合成路径中的关键基因——乙酰转移酶基因（ATF1）的表达，降低该酶的活性，从而减少乙酸酯类物质的生成[26]。 葡萄汁中不饱和脂肪酸的浓度对葡萄酒中高级醇的产生有重要影响。 乙酯类物质是另一类重要的酯类物质， 其产生主要受底物中链脂酰辅酶A 的影响[27]。与酸类物质变化相似，油酸或α-亚麻酸促进葡萄酒中乙酯类物质的生成 （表2）。Saerens 等[28]报道，添加不饱和脂肪酸可以抑制乙酰辅酶A 羧化酶AAC1 的活性， 进而释放该酶的底物——酰基辅酶A， 导致中链脂酰辅酶A 累积，促进中链脂肪酸乙酯的合成。 然而，不饱和脂肪酸含量过高时会抑制乙酯类物质的生成[29]。 与本研究结果相对应， 乙酯类物质的浓度随油酸和α-亚麻酸含量的升高而降低。添加适量油酸或α-亚麻酸可促进乙酯类物质的合成。

发酵结束后葡萄酒香气轮廓分析表明， 添加12 mg/L α-亚麻酸后， 与对照组和其它处理组相比，葡萄酒的花香和果香特征显著增强，这主要是由于具有花香、果香的苯乙醇、癸酸乙酯、乙酸乙酯、 己酸乙酯、 乙酸异戊酯含量较高引起的（表2）。 12 mg/L α-亚麻酸的（ALA-12）能够显著促进葡萄酒中醇、酯、酸类物质的合成，增强葡萄酒花香、果香特征，提高葡萄酒的感官品质。

4 结论

提高葡萄汁中油酸或α-亚麻酸的浓度，可以促进酵母的生长繁殖，提高发酵能力，增加葡萄酒的甘油含量，并促进葡萄酒中高级醇、酸类和酯类物质的生成。 该作用因不饱和脂肪酸种类和浓度不同而变化，其中添加适量（12 mg/L）α-亚麻酸可以显著增加葡萄酒中乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯和癸酸乙酯等酯类物质的含量， 产生含量适中的高级醇（＜400 mg/L），最终更加突出葡萄酒中花香和果香的香气特征，改善葡萄酒的香气品质，提高葡萄酒感官质量。