尼莫地平预处理对烧伤大鼠认知功能的影响

刘天琳 瞿敏

[摘要]目的 探討尼莫地平对烧伤大鼠认知功能的影响及其作用机制。方法 选择健康的18月龄SD雄性大鼠32只。用随机数字表法将大鼠分为4组（n=8）：对照组（C组）、手术组（S组）、尼莫地平组（D组）、尼莫地平+手术组（D+S组）。D、D+S组腹腔注射1 mg/kg尼莫地平，C、S组给予等量生理盐水;30 min后S组和D+S组给予麻醉后造烧伤模型;C组为空白对照组。术前1 d及术后第1、3、7天采用Morris水迷宫实验记录大鼠逃避潜伏期和穿越次数。Morris水迷宫完成后处死大鼠取海马，采用ELISA检测海马区的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）;采用RT-PCR法测定海马Bax、Bcl-2的mRNA表达量。流式细胞仪测量海马神经元凋亡率。结果 C、D组术后第1、3、7天平均逃避潜伏期、穿越次数与术前1 d比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与C组比较，S、D+S组术后第1、3、7天的平均逃避潜伏期延长、穿越次数减少（P<0.05）。与S组比较，D+S组术后第1、3、7天的平均逃避潜伏期缩短、穿越次数增加（P<0.05）。与S组比较，D+S组大鼠海马区TNF-α、IL-6水平降低，Bax mRNA表达量降低，Bcl-2 mRNA表达量升高，Bax/Bcl-2比值降低，凋亡率降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 尼莫地平可通过抑制炎症反应、降低海马神经元凋亡改善烧伤老龄大鼠术后认知功能障碍。

[关键词]尼莫地平;凋亡率;认知功能;烧伤

[中图分类号] R614.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）7（c）-0012-05

Effect of Nimodipine pretreatment on cognitive function in burned rats

LIU Tian-lin1   QU Min2▲

1. The Second Department of Anesthesiology， Cangzhou Central Hospital， Hebei Province， Cangzhou   061100， China; 2. Department of Anesthesiology， Children′s Hospital of Cangzhou Central Hospital， Hebei Province， Cangzhou   061100， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Nimodipine on cognitive function in burned rats and its mechanism. Methods A total of 32 healthy male SD rats aged 18 months were selected. The rats were divided into four groups （n=24） by random number table method： control group （group C）， surgery group （group S）， Nimodipine group （group D）， Nimodipine + surgery group （group D+S）. Groups D and D+S were intraperitoneally injected with 1mg/kg Nimodipine， while groups C and S were given the same amount of normal saline; 30 min later， the group S and group D+S were anesthetized and burned models were created. Group C was the blank control group. Morris water maze method was used to record the escape latency and crossing times of rats 1 day before operation and the 1st， 3rd， 7th days after operation. After completing， the Morris water maze， the rats were sacrificed and their hippocampus were collected. The tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in the hippocampus were detected by ELISA. MRNA expressions of hippocampal Bax and Bcl-2 were determined by RT-PCR. The apoptosis rate of hippocampal neurons was measured by flow cytometry. Results Compared with 1 day before the operation， there were no significant differences in the average escape latent period and crossing times between group C and group D on the 1st， 3rd， and 7th days after operation （P>0.05）. Compared with group C，the average escape latent period of group S and D+S was prolonged and the crossing times were reduced on the 1st，3rd and 7th days after operation （P>0.05）. Compared with group S ， the average escape latent period of the group D+S at the same time was shortened and the crossing times at the same time were increased on the 1st，3rd and 7th days （P<0.05）. Compared with group S， the levels of TNF-α and IL-6 in the hippocampus of the rats in the group D+S were decreased， the mRNA expression of Bax in hippocampal neurons was reduced， the mRNA expression of Bcl-2 was increased， the ratio of Bax/Bcl-2 was reduced， and the apoptosis rate was decreased （P<0.05）. Conclusion Nimodipine can improve postoperative cognitive dysfunction in burned elderly rats by inhibiting inflammatory response and decreasing hippocampal neuron apoptosis.

[Key words] Nimodipine; Apoptosis rate; Cognitive function; Burned

认知功能障碍是术后常见的神经精神并发症，多见于老年人，可导致住院时间延长，影响术后生活质量，甚至影响患者转归，危及生命。术后认知功能障碍的机制非常复杂，有炎症、氧化应激、凋亡、自噬等[1]，目前凋亡机制是当前研究热点之一[2]。

烧伤一般是指由热力、蒸汽、高温气体、火焰等引起的皮肤和/或黏膜的组织损伤[3]。重度烧伤常伴有多个器官、系统的损伤。随着烧伤的治疗理念日趋完善、治疗方法不断精进，烧伤病死率明显降低，而其引起的精神障碍逐渐成为主要问题之一。Palmu等[4]研究认为，在平均烧伤面积为9%总体表面积的烧伤患者中精神疾患发病率为60%。烧伤不仅直接破坏皮肤和局部血管的完整性，同时对毛细血管的通透性有着广泛影响。烧伤区域炎症因子激活，引发全身炎症反应[5]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）等介质参与了烧伤后的炎症反应。

尼莫地平是二氢吡啶类Ca2+通道拮抗剂，其亲脂性高，易透过血脑屏障，选择性阻断L-型Ca2+通道，同时扩张脑血管，增加脑血流量，具有脑保护作用[6]。据报道，尼莫地平可降低烧伤大鼠血浆炎症因子水平[7]，但是尼莫地平在烧伤大鼠中抗炎作用与脑保护作用的关系尚不清楚。因此，本实验建立烧伤大鼠认知功能障碍模型，探讨尼莫地平改善认知功能障碍的机制，以期为患者烧伤后防治认知功能障碍提供依据。

1材料与方法

1.1一般材料

选择健康的SD雄性大鼠32只，18月龄，体重400～550 g，室温保持在（21±1）℃。均由河北医科大学实验动物中心提供[许可证编号：SCXK（冀）2018-0001]。本研究已经过沧州市中心医院动物实验中心管理委员会批准。

用随机数字表法将32只大鼠分为4组（n=8）：对照组（C组）、尼莫地平组（D组）、手术组（S组）、尼莫地平+手术组（D+S组）。D、D+S组大鼠腹腔内注射1 mg/kg尼莫地平（德国，Bayer Schering Pharma AG公司，生产批号：BXG5XLL，规格：50 ml），C、S组大鼠给予等量生理盐水;30 min后S组和D+S组大鼠给予10%水合氯醛（江苏永华化学科技有限公司，生产批号：20180922）350 mg/kg麻醉后造烧伤模型;C组为空白对照组。所有大鼠统一进食水。此研究只选取雄性大鼠避免发情周期带来的潜在影响。

1.2动物模型制备

根据文献[8]，将铜块置于95～100℃水浴锅1 min，待大鼠麻醉后，铜块接触鼠背皮肤持续30 s。然后给予生理盐水3 ml/100 g皮下注射，进行液体复苏[9]。随后将其置于38～40℃恒温毯上进行保温，待大鼠恢复自主活动，即造模完成。D+S组造模前30 min给予1 mg/kg尼莫地平腹腔内注射;C组、D组不给予铜块烫伤造模。所有大鼠给予相同饲养环境以及相同的抓捕方式，以保证实验条件的一致性。

1.3行为学测试

术前1 d及烧伤模型建立后1、3、7 d进行Morris水迷宫（上海吉量软件科技有限公司水迷宫分析系统）测试，具體如下。

一个黑色透明的圆形水池（直径180 cm，高50 cm，深32 cm）内充满了24～26℃的水，滴入黑色无毒油墨使其变得不透明，水池被等分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4个象限，在Ⅳ象限水面以下2 cm放置一个直径12 cm、高30 cm的圆形平台。水池周围的环境和室内灯光保持不变。大鼠在测试前接受4 d训练。在每天的训练中，将大鼠分别放置在4个象限，面向池壁放入水池中，120 s内找不到平台将被引导到平台上，并允许在平台上停留15 s。每次训练结束后，泳池都要进行清洁以消除异味。每天训练4次，上午和下午同一时间各2次。术前1 d及术后第1、3、7天，将各组大鼠放入池中，记录逃避潜伏期（从落水至爬上目标平台之前所花费的时间）。取下平台，记录60 s内大鼠游过平台原位置的频率，将两次测试的平均值作为最终结果。

1.4 ELISA测海马TNF-α、IL-6

行为学测试结束后，用水合氯醛深麻醉，去除颅骨分离大鼠脑部组织，用冰生理盐水灌洗脑部组织，迅速在冰上剥离覆盖在海马组织上的大脑皮层，暴露大鼠海马组织。取出后立即在2～8℃，5000 r/min，离心5 min。将海马匀浆离心上清液储存于-80℃。根据说明书，使用ELISA法检测TNF-α及IL-6水平。

1.5采用RT-PCR法测定海马Bax、Bcl-2的mRNA表达量

从海马组织中提取总RNA。使用NanoDrop ND-2000（NanoDrop Technologies，威明顿市，美国）测定RNA浓度和纯度。使用相应的引物按照说明书进行逆转录（逆转录系统，威明顿市，美国）。实时定量PCR采用RT-PCR系统（Bio-Rad，Hercules，CA，美国），SYBR Green Master Mix试剂盒（ABI Biosystem，CA）。采用DNAMAN4.0程序设计引物，Bcl-2 mRNA上游引物为5′-GAGCGTCAACAGGGAGATGT-3′，下游引物为5′-CAGCCAGGAGAAATCAAACAG-3′。Bax mRNA上游引物为5′-TTGCTACAGGGTTTCATCCA-3′，下游引物为5′-TGTTGTTGTCCAGTTCATCG-3′。β-actin：上游引物为5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′，下游引物为5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3′。按RT-qPCR程序操作。cDNA合成：按说明书使用反转录试剂盒。采用PCR基因扩增仪进行扩增。半定量分析：于2%琼脂糖凝胶电泳槽中，分别加入PCR产物与Marker I，电压120 V，电泳35 min，于凝胶成像分析系统采集产物图像，应用Image J2x软件对图像进行分析。Bcl-2、Bax mRNA表达量采用目的片段与内采光密度值的比值来表示，重复测定3次，取平均值。

1.6流式细胞仪测凋亡率

取大鼠海马组织，制备流式细胞仪凋亡检测方法。经胰蛋白酶化后收集细胞。按照说明书使用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（KeyGEN BioTECH，中国南京），流式细胞仪（FCM，BD Biosciences，美国）检测细胞凋亡。细胞凋亡的检测采用Modfit软件进行细胞DNA含量分析，低于G1期二倍体DNA含量的细胞为凋亡细胞。

1.7统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件分析处理数据，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组内比较采用单因素方差分析和重复测量的方差分析，组间比较采用独立样本t检验;不符合正态分布者采用中位数（M）表示，比较采用非参数检验;计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1四组大鼠Morris水迷宫实验结果比较

2.1.1四组大鼠不同时间点平均逃避潜伏期的比较  在水迷宫定位航行训练中，C、D组大鼠术后第1、3、7天的平均逃避潛伏期与术前1 d比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与C组比较，S、D+S组大鼠术后第1、3、7天的平均逃避潜伏期延长，差异有统计学意义（P<0.05）。与S组比较，D+S组大鼠术后第1、3、7天的平均逃避潜伏期缩短，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

与C组同时间点比较，aP<0.05;与S组同时间点比较，bP<0.05

2.1.2四组大鼠空间探索实验结果的比较  C、D组大鼠术后第1、3、7天的穿越次数与术前1 d比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与C组比较，S、D+S组术后第1、3、7天大鼠的穿越次数减少，差异有统计学意义（P<0.05）。与S组比较，D+S组大鼠术后第1、3、7天的穿越次数增加，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

与C组同时间点比较，aP<0.05;与S组同时间点比较，bP<0.05

2.2四组大鼠海马TNF-α、IL-6表达量的比较

与C组比较，S、D+S组大鼠海马区TNF-α、IL-6水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与S组比较，D+S组大鼠海马区TNF-α、IL-6水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。C、D两组大鼠海马区TNF-α、IL-6水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表3）。

与C组比较，aP<0.05;与S组比较，bP<0.05

2.3四组大鼠海马Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表达量和Bax/Bcl-2的比较

与C组比较，S、D+S组大鼠海马区Bax mRNA表达量升高，Bcl-2 mRNA表达量降低，Bax/Bcl-2比值升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与S组比较，D+S组大鼠海马神经元Bax mRNA表达量降低、Bcl-2 mRNA表达量升高，Bax/Bcl-2比值降低，差异有统计学意义（P<0.05）。C、D两组大鼠海马区Bax、Bcl-2 mRNA表达量和Bax/Bcl-2比值比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表4）。

与C组比较，aP<0.05;与S组比较，bP<0.05

2.4四组大鼠海马神经元凋亡率的比较

与C组比较，S、D+S组大鼠术后海马神经元凋亡率升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与S组比较，D+S组大鼠术后海马神经元凋亡率降低，差异有统计学意义（P<0.05）。C、D两组大鼠术后海马神经元凋亡率比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表5）。

与C组比较，aP<0.05;与S组比较，bP<0.05

3讨论

认知功能障碍通常发生在术后早期阶段，其特征是在接受麻醉手术后近远期出现认知能力减退、记忆受损、睡眠及情感紊乱等症状[10-11]。大量证据表明，海马神经元凋亡是认知功能损害的关键一环[12-13]。据报道，尼莫地平预处理可以抑制吸入异氟醚致钙超载诱导的海马神经元凋亡，提高老龄大鼠术后的认知能力[14]，本实验探讨尼莫地平预处理对烧伤大鼠认知功能的作用及其机制。

Morris水迷宫[15]测试包括定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验可以考察动物学习记忆的能力，空间探索实验可测试动物的空间联想能力和反应记忆能力。因此，本实验选择Morris水迷宫实验来评价老年烧伤大鼠的认知能力。实验结果显示，建立大鼠烧伤模型后逃避潜伏期明显延长，穿越原平台次数明显减少，提示认知功能障碍模型制备成功。

尼莫地平是一种亲脂性钙拮抗剂。研究表明，尼莫地平可通过降低神经元凋亡，改善认知[16]。本实验结果显示，与S组比较，D+S组大鼠的术后逃避潜伏期缩短，穿越原平台次数明显增加（P<0.05），提示尼莫地平预处理可改善烧伤老龄大鼠术后记忆和学习能力，改善术后认知功能。

烧伤可引起强烈的炎症反应，烧伤面积越大，精神症状越严重，发生精神症状的患者中大约有28%的患者出现脑组织血流动力学的下降和大脑皮质及海马组织神经元的缺失[17]。本实验结果显示，与C组比较，S、D+S组大鼠海马区TNF-α、IL-6水平升高（P<0.05），提示烧伤可诱发强烈的炎症反应;与S组比较，D+S组大鼠海马区TNF-α、IL-6水平降低（P<0.05），提示尼莫地平改善烧伤老龄大鼠术后认知功能可能与降低海马区炎症反应有关。

凋亡是一种细胞程序性死亡。Bax和Bcl-2均是Bcl-2家族的重要分子，Bax蛋白表达增加提示细胞凋亡倾向增加，Bcl-2水平升高则提示凋亡概率下降，两者的表达比率决定着细胞最终的生命走向[18]。本实验结果显示，与C组比较，S、D+S组大鼠海马区Bax mRNA表达量升高，Bcl-2 mRNA表达量降低，Bax/Bcl-2比值升高（P<0.05），提示手术造成海马神经元凋亡倾向增加;与S组比较，D+S组大鼠海马神经元Bax mRNA表达量升高、Bcl-2 mRNA表达量降低，Bax/Bcl-2比值升高（P<0.05），提示尼莫地平预处理可改善海马神经元凋亡。与流式细胞仪海马神经元凋亡率结果相一致。

综上所述，尼莫地平预处理烧伤老年大鼠可改善术后认知功能，这种保护作用至少与减轻海马区炎症反应、降低海马神经元凋亡率相关。

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（收稿日期：2020-01-09）