siRNA干扰lncRNA ANRIL表达对经脂多糖诱导的结肠上皮细胞的影响及作用机制

陈 君 姜淑贤

溃疡性结肠炎(UC)是一种以黏膜炎性反应为主要病理特征的慢性非特异性结肠炎性疾病[1]。近年来调查结果显示，中国的UC发病率呈上升趋势，且患者以青壮年为主[2-4]。UC严重影响了患者的生存质量，也给社会造成沉重的医疗经济负担[5]。UC患者长链非编码INK4基因座的反义RNA(lncRNA ANRIL)表达明显增多，是UC患者可能的生物学标志物[6]。UC患者炎性因子Toll样受体4(TLR4)的表达量明显增多[7]。推测lncRNA ANRIL可能通过在UC中调控TLR4发挥作用。本实验以经脂多糖(LPS)诱导的结肠上皮细胞FHC为研究模型，通过观察lncRNA ANRIL对FHC细胞凋亡及对炎性因子TLR4的影响，探讨其在UC中的具体作用，以期为UC的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞培养、分组及干预

首先配制细胞培养液，在DMEM培养基(美国Gibco公司)中加入2.5%胎牛血清。将胎儿结肠上皮细胞FHC(上海冠异生物公司)在37 ℃、5% CO2、100%湿度培养箱中进行培养。每2～3 d更换1次培养液，5～6 d传代1次。将FHC细胞随机分为4组：空白组、模型组、对照组和siRNA-ANRIL组。空白组不予处理，模型组、对照组和siRNA-ANRIL组用8 μg/mL LPS 24 h诱导FHC细胞模拟UC样改变，检测细胞活力和炎性因子水平来判断UC细胞模型是否造模成功[8]。当FHC细胞汇合度大约达到50%时，对照组和siRNA-ANRIL组分别转染siRNA-NC及siRNA-ANRIL[9]，经过6 h后，将培养液换成含10%血清的DMEM培养基，培养48 h后，进行下一步实验。

1.2 MTT法检测细胞活力

将FHC细胞接种于96孔板中，进行转染，48 h后，舍弃培养液，每孔加入20 μL终浓度为0.5 mg/mL的MTT，37 ℃继续培养4 h后，舍弃上清液，每孔加入150 μL的二甲基亚砜(DMSO)，通过震荡使紫色结晶物充分溶解，使用酶标仪(Thermo Scientific MultiSkan Go)于560 nm波长处测吸光度(OD)值[10]。

1.3 流式细胞术检测细胞凋亡率

首先将FHC细胞接种于6孔板中，培养后进行转染。48 h后，用无乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶消化细胞，将细胞收集到离心管中，1 000 g离心3 min后，吸出上清液。再加入1 mL预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)，重悬细胞，并转移至1.5 mL离心管中，离心，吸出上清液。加入195 μL结合液，重悬细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC轻轻混匀，最后加入10 μL PI染液轻轻混匀，室温避光孵育15 min[11]。

1.4 荧光定量PCR检测ANRIL mRNA、TLR4 mRNA含量

将FHC细胞接种于6孔板，培养后进行转染。48 h后收集细胞，采用TRIzol试剂(日本TaKaRa公司)提取细胞中的总RNA，随后用逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)对样品RNA进行逆转录，进一步对cDNA进行扩增。扩增条件是：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火32 s，72 ℃延伸30 s，共计50个循环反应。采用2-ΔΔCt法计算相对表达量[11]。引物由上海吉玛公司设计，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5 Western blot检测细胞TLR4蛋白表达

将FHC细胞接种于6孔板，培养后进行转染。48 h后收集细胞，加入细胞裂解液裂解细胞，低温离心，取上清液采用BCA试剂盒进行蛋白定量。配制SDS-PAGE凝胶，上样后，进行电泳、转膜、封闭。在4 ℃条件下兔抗鼠TLR4多克隆抗体(1∶500，美国Abcam公司)，过夜。在室温条件下孵育山羊抗兔二抗(1︰3 000，美国Proteintech公司)。使用ChemiDocTM XRS凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)成像，并用Image J进行半定量分析[12]。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组细胞活力比较

空白组、模型组、对照组和siRNA-ANRIL组OD值分别为0.82±0.07、0.59±0.08、0.62±0.05和0.74±0.08，差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较，模型组OD值降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，对照组OD值无显著变化，差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，siRNA-ANRIL组OD值显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明干扰lncRNA ANRIL表达可增强经LPS诱导的FHC细胞的活力。

2.2 各组细胞凋亡率比较

空白组、模型组、对照组和siRNA-ANRIL组细胞凋亡率分别为0、(42.7±3.6)%、(46.2±4.2)%和(6.3±0.4)%，差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较，模型组细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，对照组细胞凋亡率无显著变化，差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，siRNA-ANRIL组细胞凋亡率降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。上述结果表明干扰lncRNA ANRIL表达可降低经LPS诱导的FHC细胞的凋亡率。

图1 各组细胞凋亡率比较 流式细胞术Annexin V-PI染色 A 空白组 B 模型组 C 对照组 D siRNA-ANRIL组

2.3 各组ANRIL mRNA、TLR4 mRNA水平比较

与空白组比较，模型组ANRIL mRNA、TLR4 mRNA水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，对照组ANRIL mRNA、TLR4 mRNA水平无显著变化，差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，siRNA-ANRIL组ANRIL mRNA、TLR4 mRNA水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明干扰lncRNA ANRIL表达可降低经LPS诱导的FHC TLR4 mRNA水平。见表2。

表2 各组ANRIL mRNA、TLR4 mRNA Ct值比较

2.4 各组TLR4蛋白表达水平比较

空白组、模型组、对照组和siRNA-ANRIL组TLR4蛋白表达水平见图2。经Image J半定量分析，结果分别为0.26±0.05、0.98±0.06、0.89±0.12和0.36±0.04，差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较，模型组TLR4蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，对照组TLR4蛋白表达水平无显著变化，差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，siRNA-ANRIL组TLR4蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明干扰lncRNA ANRIL表达可降低经LPS诱导的FHC TLR4 蛋白表达水平。

图2 各组TLR4蛋白的电泳图

3 讨论

UC发病机制尚未完全明确，多数学者认为其是环境、免疫和遗传共同作用的结果。近年来，UC的发病率逐渐升高，严重影响人们的健康安全。随着病程的进展，UC患者可能发生并发症，如中毒性巨结肠、结肠出血等，若不及时干预可能导致死亡。研究UC发病机制对于临床治疗具有积极的指导意义。

利用LPS诱导FHC细胞发生炎性损伤来构建体外UC模型，出现细胞活力显著减弱，炎性因子水平显著提高，即为体外UC细胞模型构建成功；siRNA-ANRIL组ANRIL mRNA表达水平低于对照组，表明siRNA干扰lncRNA ANRIL表达成功。本研究结果显示siRNA-ANRIL组细胞OD值高于对照组，而细胞凋亡率低于对照组，表明干扰lncRNA ANRIL表达可有效抑制LPS对FHC细胞的损伤，增强细胞活力，降低细胞凋亡率。

TLR4是TLR家族中较早被发现的一个成员，作为介导炎性反应的主体，普遍分布于多种免疫细胞的膜表面，具有识别炎性反应、应激、机体损伤等相关内源性配体的作用[13-14]。目前，已有许多研究证实TLR4参与了UC的发病及进展过程[15-17]。本实验结果显示，siRNA-ANRIL组TLR4 mRNA和TLR4表达水平均低于对照组，表明干扰lncRNA ANRIL表达可降低LPS诱导的FHC细胞TLR4表达水平，进而发挥其保护作用。LncRNA ANRIL 的作用机制主要有两个方面：一方面 LncRNA ANRIL可与多梳抑制复合物的核心亚基EZH2 相互作用，介导组蛋白 H3K27 的三甲基化，沉默基因转录；另一方面LncRNA ANRIL也可与多梳抑制复合物相互作用，催化 H3K27 三甲基化，沉默靶基因表达[18]。LncRNA ANRIL是否可通过与多梳抑制复合物相互作用来抑制TLR4，有待后续进一步研究。

综上所述，siRNA干扰LncRNA ANRIL表达可增强FHC细胞活力，降低凋亡率，并抑制炎性因子TLR4表达，从而起到保护细胞的作用，提示LncRNA ANRIL可作为一类新型的具有生物学功能的临床标志物，具有广阔的临床应用前景，对UC的发生、发展及治疗有重要作用。本实验有助于进一步认识LncRNA ANRIL在UC中的作用，有望为UC的治疗提供新的靶点，对后续的科研有进一步的指导意义。