miR-301a-3p在胰腺癌中的表达及与患者预后关系的研究

范金斌 胡成侠

胰腺癌在常见的恶性肿瘤中侵袭性较高、预后较差，手术切除是治疗胰腺癌的有效方法，但由于缺乏有效的早期诊断方法，导致患者的生存率较低[1]。目前影像学技术和血清学标志物对胰腺癌诊断的敏感度和特异度均有待进一步提高[2-3]。因此，为了改善胰腺癌患者的预后，迫切需要寻找特异度更高、侵袭性更小的诊断标志物。微RNA(miRNA)是一类小分子非编码RNA，在转录后水平上可作为蛋白质编码基因的内源性调节因子[4]，有望成为疾病新的诊断及预后判断标志物。miR-301a-3p在多种恶性肿瘤中均存在异常表达[5-6]，但目前其在胰腺癌中表达的相关报道较少。本研究探讨了miR-301a-3p在胰腺癌中的表达水平及其与患者预后的关系，以期为胰腺癌的早期干预提供更多依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2016年1月至2019年1月宿迁市中医院收治的66例胰腺癌患者的手术病理标本。纳入标准：(1)符合2017年《NCCN胰腺癌临床实践指南》[7]中有关胰腺癌的诊断标准；(2)接受根治性手术治疗；(3)术前未行放射治疗、化学治疗等抗肿瘤治疗；(4)依从性好，随访记录完整。排除标准：(1)非首次诊断的患者；(2)围手术期死亡者。66例患者中，男性46例，女性20例，平均年龄为(54.5±6.2)岁。另选择同期在本院行健康体检的66位志愿者作为健康对照，其中男性42人，女性24人，平均年龄为(52.6±5.8)岁。胰腺癌患者与健康对照组志愿者的性别构成、平均年龄的差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会审查通过。

1.2 血浆及组织中miR-301a-3p检测

患者入院后3 d内完成静脉血采集。患者或志愿者均抽取肘正中静脉血5～10 mL，3 000 r/min离心5 min，分离血浆后低温冻存。患者的组织标本保存于本院实验室，每份样品均包括肿瘤组织及癌旁组织，癌旁组织定义为距离肿瘤边缘3 cm内的组织。使用TRIzol试剂盒(购自美国Invitrogen公司)提取组织标本和血液标本中的总RNA，逆转录合成cDNA，实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测miR-301a-3p相对表达量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。RT-RCR反应体积为20 μL，反应条件为95 ℃预变性3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，共40个循环，设置4个重复孔。以GAPDH作为内参基因，计算Ct值，采用2-△△Ct法检测miR-301a-3p的相对表达量。

表1 引物序列

1.3 临床资料收集

收集患者的病历资料和手术记录，选取指标包括性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、是否有淋巴结转移、是否有脉管癌栓、糖类抗原19-9(CA19-9)水平及癌胚抗原(CEA)水平等。CA19-9、CEA水平均以入院后第1次肿瘤标志物检测结果为参考，入院后在清晨空腹状态下采集静脉血，由本院检验科完成各项肿瘤标志物的检测，以CA19-9≥37 U/mL、CEA≥5.0 ng/mL为阳性标准。

1.4 随访

采用门诊复查或电话的形式进行随访。术后每个月随访1次，直至随访终点或失访，总生存期(OS)定义为自手术当日至因任何原因死亡的时间。随访截止时间为2019年12月31日。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 miR-301a-3p在组织、血浆中的表达水平

miR-301a-3p在胰腺癌肿瘤组织、癌旁组织中的相对表达量分别为10.64±2.12、5.64±1.73，在胰腺癌患者血浆及健康志愿者血浆中的相对表达量分别为5.36±1.13、1.28±0.29，差异均具有统计学意义(P均<0.05)。Spearman等级相关检验发现，miR-301a-3p在胰腺癌患者的肿瘤组织与血浆中的表达水平呈正相关关系(r=0.539，P<0.01)。见图1。

图1 各组血浆及组织中miR-301a-3p的相对表达量 A 肿瘤组织和癌旁组织 B 胰腺癌患者和健康志愿者的血浆 C 胰腺癌患者的血浆和肿瘤组织

2.2 肿瘤组织中miR-301a-3p的表达水平对临床病理参数的影响

肿瘤组织中miR-301a-3p的中位表达水平为10.22，以此为标准，将患者分为miR-301a-3p低表达组和miR-301a-3p高表达组。单因素分析结果显示，与miR-301a-3p高表达组患者相比较，miR-301a-3p低表达组患者中肿瘤直径<5 cm的患者比例较高，有淋巴结转移及CA19-9水平升高的患者比例则较低，差异均具有统计学意义(P均<0.05)。见表2。将单因素分析中有意义的指标纳入多因素Logistic风险模型，结果显示肿瘤大小、是否有淋巴结转移、CA19-9水平是影响肿瘤组织中miR-301a-3p表达水平的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表2 肿瘤组织中miR-301a-3p表达水平对临床病理参数影响的单因素分析

表3 肿瘤组织中miR-301a-3p的表达水平对临床病理参数影响的多因素分析

2.3 血浆miR-301a-3p与肿瘤标志物联合诊断的价值

因变量为二分类变量，对照组标记为0，胰腺癌组标记为1，自变量为CEA、CA19-9、血浆miR-301a-3p相对表达量。结果显示，CEA、CA19-9、miR-301a-3p单独诊断胰腺癌时的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.576、0.693、0.757，三者联合诊断时为0.806，提示联合诊断的准确度明显优于单独诊断。见表4、图2。

表4 血浆miR-301a-3p与肿瘤标志物联合诊断的价值

图2 各指标诊断胰腺癌的ROC曲线

2.4 miR-301a-3p的表达水平对患者OS的影响

Log-rank检验发现，血浆miR-301a-3p高表达组患者的OS显著短于血浆miR-301a-3p低表达组(χ2=5.524，P=0.018)；组织miR-301a-3p高表达组患者的OS显著短于miR-301a-3p低表达组患者(χ2=22.163，P<0.001)。见图3。

图3 miR-301a-3p表达对患者预后的影响 A 血浆miR-301a-3p B 组织miR-301a-3p

3 讨论

胰腺癌是一种常见的消化系统肿瘤，具有恶性程度高、预后差、病死率高等特点[8]。流行病学调查显示，胰腺癌的发病率呈逐年上升趋势，全世界每年新发胰腺癌20多万例[9]。手术切除是目前胰腺癌的主要治疗手段，但由于局部血管侵犯和远处转移，大多数患者并不适合行根治术，只能依靠放射治疗、化学治疗等辅助手段，这些措施可在一定程度上延长患者的生命，但疗效较差[10]。miRNA作为一种内源性非编码小RNA，具有重要的生物学功能。有多项研究表明，miRNA与胰腺癌的发生、发展密切相关[11-12]。Zhang等[13]的研究发现，miR-301a-3p在结直肠癌组织和细胞系(HT29和SW620)中显著上调。miR-301a-3p的过表达可明显促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制其凋亡。同时，上调miR-301a-3p的表达可升高Bax、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、caspase-9、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9的表达，使结肠癌细胞的侵袭性更强。目前关于miR-301a-3p与胰腺癌之间关系的报道较少。本研究通过分析胰腺癌组织及患者血浆中miR-301a-3p的表达水平，以期为胰腺癌的临床治疗提供新的思路和方法。

本研究结果指出，miR-301a-3p在胰腺癌肿瘤组织中的相对表达量显著高于癌旁组织；与健康志愿者相比，胰腺癌患者血浆miR-301a-3p的相对表达量明显升高，提示胰腺癌会诱导患者机体内miR-301a-3p异常高表达。本研究进一步分析表明，肿瘤大小、是否有淋巴结转移、CA19-9水平是影响肿瘤组织中miR-301a-3p表达水平的独立危险因素，提示miR-301a-3p的表达水平与胰腺癌的发生、发展密切相关，且对患者的临床病理特征有显著的不良影响。

CEA是从结肠癌和胚胎组织中提取的一种肿瘤相关抗原，是一种具有人类胚胎抗原特性的酸性糖蛋白，存在于内胚层细胞分化而来的肿瘤细胞表面，是细胞膜的结构蛋白。CA19-9属低聚糖肿瘤相关抗原，是细胞膜上的糖脂质，目前常用于诊断胰腺癌[14]。血清中CA19-9以唾液黏蛋白形式存在，分布于正常成年人的胰腺、胆管上皮等处，是存在于血液循环中的胃肠道肿瘤相关抗原。CEA及CA19-9对胰腺癌的诊断具有一定特异度，但敏感度并不能满足临床检测的需求，并且两者因其非器官特异性，会影响临床判断，因此不能单独作为胰腺癌的肿瘤标志物。本研究发现，CEA、CA19-9、miR-301a-3p三者联合检测诊断胰腺癌的准确度明显优于单独诊断，提示CEA、CA19-9及miR-301a-3p虽然在胰腺癌早期诊断方面具有一定的参考价值，但三者均不能单独作为胰腺癌的早期诊断分子标志物，而三者联合检测可有效提高诊断的敏感度及特异度。本研究通过随访发现，血浆miR-301a-3p高表达组患者的OS显著短于血浆miR-301a-3p低表达组，组织miR-301a-3p高表达组患者的OS显著短于miR-301a-3p低表达组患者，提示miR-301a-3p在组织、血浆中的表达水平均对胰腺癌患者的预后具有良好的指示作用。本研究的不足之处在于样本量较小，且为单中心研究，今后将收集更多的样本进一步研究，以期得到更具说服力的证据。