Hsa-circRNA-102685在克罗恩病黏膜组织中的表达及意义

秦芳芳 曹 勇 张 喆 唐与浓

克罗恩病(CD)是一种肠道慢性炎性疾病，发病率呈逐年升高趋势[1]。CD的发病原因尚未完全明确，其具有复发率高、并发症多等特点[2-3]。随着CD的进展，患者可出现肠道狭窄、瘘管等肠道结构性损伤，严重者可发生癌变[4]。因此，尽早评估CD患者的病情，对于制定有效干预措施，从而改善患者的预后具有重要意义。有研究显示，血清胆碱酯酶、红细胞沉降率(ESR)等指标评估CD严重程度的敏感度均较低[5]。因此，急需探寻敏感度、准确度较高的生物学标志物用于评估CD的严重程度。有研究指出，Toll样受体可通过调节B细胞的促炎活性参与CD的发生、发展过程[6-7]，另有细胞研究表明环状RNA-102685(hsa-circRNA-102685)可能参与了Toll样受体信号转导通路[8]，因此推测hsa-circRNA-102685可能参与了CD的发生和发展。本文探讨了hsa-circRNA-102685在CD黏膜组织中的表达水平及意义，并分析其与CD严重程度及患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年6月至2018年6月中国医科大学附属盛京医院及辽宁省金秋医院收治的共104例CD患者作为研究对象(设为CD组)，CD诊断标准参照《中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》[9]。结肠镜检查结果显示，CD患者中缓解期41例，活动期63例。纳入标准：(1)符合CD的诊断标准；(2)初次确诊为CD；(3)年龄≥18岁；(4)入组前未服用免疫抑制剂、非甾体类抗炎药等；(5)签署知情同意书。排除标准：(1)合并消化道恶性肿瘤；(2)合并严重的心、肝、肾功能障碍；(3)合并全身感染性疾病；(4)随访失联。选取同期在本院接受单发息肉切除术的100例结肠息肉患者作为对照组。104例CD患者中男性64例，女性40例，年龄18～36岁，平均年龄为(27.93±3.19)岁。对照组中男性58例，女性42例，年龄20～34岁，平均年龄为(28.44±3.23)岁。两组在性别(χ2=0.266，P=0.606)、年龄(t=1.135，P=0.258)方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获得医院医学伦理委员会批准。

1.2 检测方法

抽取患者入组次日清晨空腹外周静脉血10 mL，室温下4 000 r/min离心10 min，离心半径为8 cm，分离上层血清，置于-20 ℃冰箱，待测。采用免疫比浊法检测血清C反应蛋白(CRP)水平，试剂盒购自北京世纪沃德生物科技有限公司；采用Sysmex XE-5000全自动血细胞分析仪(购自日本希森美康)测定血液ESR、白蛋白、血红蛋白水平。

采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测CD组和对照组的hsa-circRNA-102685相对表达量。采集患者黏膜组织后，30 min内将保存组织样本的冻存管置于液氮罐中保存待检。在液氮中研磨CD患者的炎性组织及对照组的正常黏膜组织，采用TRIzol试剂法提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA的纯度及表达水平。应用核酸蛋白仪和琼脂糖电泳对提取的RNA进行分析。取5 μL总RNA，85 ℃水浴5 min后加入反转录反应液，44 ℃孵育60 min后终止，留取产物待用。扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。以GAPDH作为内参，用2-ΔΔCt表示hsa-circRNA-102685的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 CD严重程度评估

根据克罗恩病活动指数(CDAI)评分评估疾病活动期的严重程度，主要包括腹痛、腹部包块、腹泻及伴随疾病4个方面[9]。腹痛按轻度、中度、重度疼痛分别记为1、2、3分；腹部包块按照可疑、确定、伴触痛分别记为1、2、3分；腹泻每日1次记1分；伴随疾病包括关节痛、虹膜炎、结节性红斑、坏疽性脓皮病、阿弗他溃疡、裂沟、新瘘管、脓肿，每种症状记1分。CDAI评分≤4分为缓解期，>4分为活动期。CDAI评分5～7分为轻度，8～16分为中度，>16分为重度。

1.4 随访

采用复诊方式对CD患者进行为期3年的跟踪随访，记录患者预后情况。本研究将复发、CD相关再入院及发生CD相关结直肠癌定义为预后不良。随访起始时间为2013年6月20日，截止时间为2018年6月13日。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 两组hsa-circRNA-102685相对表达量的比较

CD组患者hsa-circRNA-102685的相对表达量为4.27±0.93，高于对照组(2.35±0.62)，且差异具有统计学意义(t=17.280，P<0.05)。

2.2 不同病变部位CD患者hsa-circRNA-102685相对表达量的比较

CD组患者中，病变位于回肠末段(n=37)、结肠(n=34)、回结肠(n=33)者的hsa-circRNA-102685相对表达量分别为4.31±1.02、4.26±0.95、4.24±0.89。不同病变部位hsa-circRNA-102685相对表达量的差异无统计学意义(F=0.014，P=0.991)。

2.3 不同严重程度CD患者hsa-circRNA-102685相对表达量的比较

缓解期CD患者hsa-circRNA-102685的相对表达量为3.72±0.87，低于活动期(4.62±0.95)，差异有统计学意义(t=4.878，P<0.001)。63例活动期CD患者按照CDAI评分评估为轻度组19例、中度组25例、重度组19例。轻度组、中度组、重度组CD患者的hsa-circRNA-102685相对表达量分别为3.93±0.90、4.55±0.94、5.40±1.03，3组比较差异有统计学意义(F=11.768，P<0.001)，其中重度组hsa-circRNA-102685的相对表达量高于中度组及轻度组，且中度组高于轻度组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

2.4 hsa-circRNA-102685与CD患者预后的关系

104例CD患者在随访期间的预后不良发生率为54.81%(57/104)，其中CD复发23例(22.12%)、CD相关再入院33例(31.73%)、结肠癌变1例(0.96%)。预后不良组患者hsa-circRNA-102685的相对表达量为4.83±1.02，高于预后良好组(3.59±0.96)，差异有统计学意义(t=6.335，P<0.001)。Hsa-circRNA-102685评估CD患者预后的ROC曲线下面积(AUC)、敏感度、特异度和最佳截断点分别为0.806(95%CI：0.716～0.877)、84.21%、68.09%和3.81。见图1。

图1 hsa-circRNA-102685评估CD患者预后的ROC曲线

2.5 不同预后患者的基本资料比较

预后良好组与预后不良组在年龄、性别、体质指数(BMI)、病变部位、肠道损伤、治疗方案、治疗时间方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)；预后不良组中吸烟、肛周病变、肠切除术史、疾病穿透行为的占比及CRP、ESR水平高于预后良好组，而白蛋白、血红蛋白水平低于预后良好组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。具体见表2。

表2 不同预后患者的基本资料比较

2.6 影响CD患者预后的因素分析

根据CRP、ESR、白蛋白、血红蛋白、hsa-circRNA-102685评估CD患者预后的最佳截断值将其转换为二分类变量。将吸烟(否=0，是=1)、肛周病变(无=0，有=1)、肠切除术史(无=0，有=1)、疾病行为(非狭窄非穿透、狭窄=0，穿透=1)、CRP(<80.37 μmol/L=0，≥80.37 μmol/L=1)、ESR(<12.59 mm/h=0，≥12.59 mm/h=1)、白蛋白(≥28.53 g/L=0，<28.53 g/L=1)、血红蛋白(≥124.15 g/L=0，<124.15 g/L=1)、hsa-circRNA-102685(<3.82=0，≥3.82=1)作为自变量，将CD患者的预后情况(预后良好=0，预后不良=1)作为因变量，纳入多因素Logistic回归模型，结果显示吸烟、肛周病变、肠切除术史、疾病行为、hsa-circRNA-102685与CD患者的预后密切相关。见表3。

表3 影响CD患者预后的因素分析

3 讨论

circRNA是区别于传统线性RNA的一类新型非编码RNA，具有闭合环状结构，在人类细胞中广泛表达[10-11]。circRNA可通过吸附miRNA调控靶基因的表达[12]。近年来，关于circRNA用于疾病诊断及靶向治疗已成为临床研究的热点。Hsa-circRNA-102685作为circRNA家族一员，可参与细胞凋亡过程。有研究表明，hsa-circRNA-102685对p53基因具有调节作用，而p53基因的异常表达与CD的发生、发展密切相关[8]。目前有关hsa-circRNA-102685在CD中的表达水平及与患者病情之间关系的报道较少，本文就hsa-circRNA-102685与CD严重程度的关系进行了探讨。

本研究结果显示，CD组患者hsa-circRNA-102685的相对表达量低于对照组，提示hsa-circRNA-102685可能与CD的发生存在联系。进一步研究发现，活动期CD患者的hsa-circRNA-102685相对表达量高于缓解期，提示hsa-circRNA-102685可作为评估CD病情的潜在标志物。随后，本研究比较了不同严重程度CD患者的hsa-circRNA-102685相对表达量，结果显示重度组患者的hsa-circRNA-102685相对表达量高于中度组及轻度组，而中度组高于轻度组，表明hsa-circRNA-102685可能与CD严重程度相关。本研究通过随访发现，预后不良组患者的hsa-circRNA-102685相对表达量高于预后良好组，提示检测hsa-circRNA-102685相对表达量可能有助于评估CD患者的预后。因此，本研究进一步构建了hsa-circRNA-102685评估CD患者预后的ROC曲线，结果显示hsa-circRNA-102685评估患者预后的AUC为0.806，提示效能较高。多因素Logistic回归分析显示，吸烟、肛周病变、肠道损伤、肠切除术史、疾病行为与CD患者的预后密切相关，与既往的研究结果相符[13-14]。

Toll样受体可识别肠道内致病菌的DNA，且活化后的Toll样受体可通过激活肠道白细胞介素-10(IL-10)等炎性因子，参与肠道免疫反应[15]。肠道菌群免疫失衡后被Toll样受体识别，在机体免疫、肠道炎性反应、遗传基因等多种因素作用下表达升高，引起下游相关因子如IL-1、核因子-κB的变化，促使CD发生[16-17]，hsa-circRNA-102685可促进Toll样受体表达[8]。此外，hsa-circRNA-102685具有调节p53基因表达的作用，p53可促进炎性因子聚集，且p53磷酸化后可促进结肠黏膜细胞凋亡，并调节其下游基因，参与CD的病理生理过程[18]。由此推测，hsa-circRNA-102685可能通过调节Toll样受体及p53的表达，参与CD的疾病进展。

综上所述，hsa-circRNA-102685与CD患者的严重程度及预后密切相关，检测hsa-circRNA-102685表达水平有助于评估患者的预后。今后将对hsa-circRNA-102685参与CD患者严重程度及预后的病理生理机制作进一步探讨。