酶响应纳米药物的研究进展*

安静，万江陵，杨祥良，李子福

(1.华中科技大学生命科学与技术学院，武汉 430074；2.国家纳米药物工程技术研究中心，武汉 430074)

随着纳米技术的蓬勃发展，一系列纳米药物输送系统(nano drug delivery system，NDDS)被开发出来[1]。基于有机和无机纳米材料的独特理化性质，结合化学治疗(化疗)、光热治疗、放射治疗、基因治疗、细胞治疗和免疫疗法等开发诊疗纳米药物的研究报道层出不穷[2]。这些纳米药物有生物稳定性高、靶向性强、血液循环半衰期长、高效、低毒的优势[3]。其中，抗肿瘤纳米药物主要依靠高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR)靶向肿瘤部位，但研究显示过去开发的纳米药物肿瘤靶向效率的中位数仅为0.7%[4]，并且进入肿瘤部位仅仅是药物输送的第一步，纳米粒运载的药物在病灶及时有效地释放也是其起到治疗效果的关键[5]。根据生物标志物、受体和肿瘤微环境构建的刺激响应型智能抗肿瘤纳米药物，通过主动靶向递药和刺激响应释放产生显著的抗癌疗效、降低药物的副作用，用于癌症的精确治疗，是“改良”版纳米药物，更具临床转化潜力。这些智能纳米药物对肿瘤外部或内部的刺激具有反应能力，有可激活的成像信号或受激活后释放药物的特性，相比普通诊疗纳米药物，成像对比度或治疗效果增强。光、温度、超声波或磁场等外源性刺激一般被用来触发纳米药物的响应性变化，而缺氧、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、酸性pH、过表达的受体或酶、细胞内变化的三磷酸腺苷(ATP)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)或谷胱甘肽(glutathione，GSH)等内源性刺激可提高药物的肿瘤靶向和在肿瘤微环境中的释药[1]。这样的智能纳米药物是抗肿瘤纳米药物未来的发展趋势，当刺激存在时，纳米药物结构或理化性质变化，释放出药物，产生细胞毒性。其中，人体内的酶异常表达和活性失调是许多疾病的病理学基础，失调的酶在肿瘤诊疗中非常有价值，可通过检测酶诊断疾病，抑制酶的表达来治疗疾病。内源性酶也可作为刺激响应型智能纳米药物的生物触发器，是近年来智能纳米药物的研究热点，许多抗肿瘤疗效显著的酶响应纳米药物已被开发出来。笔者在本文综述近年来酶响应纳米药物的研究进展，围绕其设计原理和治疗效果展开讨论，并对酶响应纳米药物的临床转化面临的机遇与挑战进行展望。

1 酶响应纳米药物概述

1.1酶催化作用的特点 酶是由活细胞产生的生物催化剂，几乎参与生物体内所有生化代谢过程[6]，它对底物种类和结构要求严格，具有高度的特异性，催化功能依赖于自身完整结构。由于酶的作用，生物体内的化学反应在极为温和的条件下也能高效地进行。若因遗传缺陷或其他原因造成酶的活性异常，常常引发物质代谢紊乱，甚至发生疾病，多种癌症的发生都伴随着酶异常表达。

1.2酶响应纳米药物的设计原理 酶响应纳米药物的一般设计原理为：酶底物片段通过共价键、疏水作用或静电作用等与纳米材料偶联，赋予纳米载体酶敏感的特性，该纳米载体包封治疗剂或造影剂，入血后依靠EPR效应进入肿瘤组织，暴露于高浓度的酶并引发结构改变，通过纳米载体解组装或偶联键断裂释放药物，从而提高治疗效果或增强成像作用。

1.3酶响应纳米药物的独特优势 相比于其他类型的刺激响应性纳米药物，酶响应的诊疗纳米药物具有以下优点：①酶是内源性物质，不需要外加磁场、超声波或光等，具有内在生物相容性和生物安全性的优点；②酶促反应反应迅速，反应条件温和(体温、温和pH、水溶液)；③酶对底物有选择性，避免药物非特异靶向和释药[7-8]；④酶在肿瘤发展的不同时期表达水平不同，可根据患者肿瘤部位的酶水平个性化给药，实现肿瘤个性化精准治疗；⑤一些酶对底物要求不严格，允许有一定变化空间，例如蛋白酶底物肽可改变N端或C端氨基酸残基，这样允许肽段偶联不同的纳米材料。

2 病灶部位异常表达的酶

在多种癌症中，肿瘤组织的细胞间质或细胞内往往出现酶的异常表达，它们是癌症的治疗靶点，例如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)、组织蛋白酶B、透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)、分泌性磷脂酶A2(secreted phospholipase A2，sPLA2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、前列腺抗原(prostate specific antigen，PSA)、氧化还原酶、α-淀粉酶和γ-谷氨酰转移酶(γ-glutamyl transpep tidase，GGT)，这些酶的表达水平与肿瘤的发生发展有关。

2.1MMPs的病理特点 MMPs在多种重大疾病(如恶性肿瘤、心血管疾病以及关节炎等)表达异常，尤其在肿瘤的发展过程中大量表达。MMPs通过降解ECM使肿瘤细胞侵袭临近正常组织，同时，ECM的改变释放出隔离的生长因子，或产生生物活性片段促进肿瘤生长，例如，MMP-9降解ECM释放血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，并切割IV型胶原生成血管生成抑制剂肿瘤抑素(tumstatin)[9]。因此，MMPs激活释药的抗肿瘤纳米药物有望抑制肿瘤恶化发展。人类基因组有24个MMP基因，表达23种MMPs，它在生理状况下主要功能是降解ECM，调节细胞与细胞、细胞与ECM的相互作用，重塑基质结构；MMPs也能影响生长因子和细胞表面信号分子的功能，从而影响细胞的增殖、分化和凋亡。其中， MMP-2和MMP-9在乳腺癌、直肠癌、胰腺癌和肺癌的肿瘤部位过表达；MMP-3在乳腺癌的肿瘤部位过表达，促使乳腺癌的发生发展；MMP-12在鳞状细胞癌的肿瘤组织过表达，与肿瘤浸润有关；MMP-12、MMP-13在肺癌的肿瘤部位过表达[10]。

2.2组织蛋白酶B的病理特点 组织蛋白酶B是恶性肿瘤的关键生物标志物，它是目前研究最为透彻的溶酶体酶之一[11-12]，临床发现组织蛋白酶B在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌和子宫内膜癌等多种癌症的细胞内高水平表达。因此，利用组织蛋白酶B激活释药的抗肿瘤药物有望用于多种恶性肿瘤治疗。组织蛋白酶B属于木瓜蛋白酶家族，定位在溶酶体或内质体。其可与半胱氨酸蛋白酶抑制剂和膜联蛋白II四聚体相互作用，降解IV型胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋白，改变ECM结构，促使细胞迁移。组织蛋白酶B还能影响MMPs、纤溶酶和尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinasetype plasminogen activator，uPA)的活性。

2.3HAase的病理特点 HAase在多种癌症(如膀胱癌、前列腺癌、转移性乳腺癌)表达水平升高，它能将高分子量透明质酸(hyaluronan，HA)降解为低分子量的HA片段，这些低分子量HA片段刺激内皮细胞增殖、粘附和迁移，促进肿瘤血管生成。其中HYAL1亚型是主要的肿瘤内源性HAase，恶性乳腺癌细胞、浸润性导管癌组织和乳腺癌转移淋巴结中HYAL1过表达，活性升高[13]。在应用中，肿瘤部位过表达的HAase水解HA，释放以HA为载体的纳米药物。HA在膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌和结肠癌等多种癌症中浓度升高，应用中HA可作为纳米药物的无毒载体、MSN的封端剂和抗肿瘤药物靶点，它与CD44、CD168、透明质酸内吞受体，Toll样受体-2 和Toll样受体-4相互作用参与细胞增殖、转移和组织水化，其中CD44是主要的作用受体。

2.4sPLA2的病理特点 sPLA2在前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、关节炎和动脉粥样硬化等多种疾病中过表达，特别是在发展成高级别的转移性前列腺肿瘤，sPLA2IIA的表达水平增加22倍。sPLA2被广泛用于抗前列腺癌、抗乳腺癌药物的开发。这种酶能水解磷脂sn-2位的酯基，释放溶血磷脂和游离脂肪酸，由于其仅对磷脂形成的脂质体囊泡有水解作用，而对磷脂单体不敏感，sPLA2响应性抗肿瘤药物一般设计成脂质体。生理状况下sPLA2可降解膳食磷脂、防止细菌感染和花生四烯酸的产生，并且有抗病毒作用，是一种Ca2+依赖型磷酯酶[14-15]。

2.5ALP的病理特点 ALP主要由肝脏合成，几乎分布于机体所有组织中，但血液含量通常很低，在一些病理状态，包括骨恶性肿瘤、恶性肿瘤骨转移、肝硬化、肝癌，血清ALP升高[16]。ALP是乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤骨转移的常见生物标志物[17-18]，临床用于肿瘤骨转移的筛查。ALP在骨肉瘤表达升高，可用于开发ALP响应抗骨肉瘤纳米药物。ALP的主要作用是使蛋白质、核苷酸和生物碱去磷酸化，是一组同工酶。

2.6PSA的病理特点 PSA在前列腺组织选择性表达，在前列腺肿瘤中，PSA的水平相对于非病变前列腺组织显著升高，高水平的PSA易渗漏到血清，因此PSA是一种临床上诊断前列腺癌的血清标志物。前列腺癌患者的PSA仅在前列腺有酶活性，而在其他正常组织均无PSA活性，因此，PSA适合用于设计前列腺靶向药物。此外，血清中的PSA无酶活性，并与血浆蛋白酶抑制剂a1抗糜蛋白酶和a2微球蛋白形成复合物，这避免了PSA响应纳米药物在体循环中提前释药[19]。

2.7氧化还原酶的病理特点 氧化还原酶被用于许多载药系统和生物传感器的设计中，这是由于一些疾病(如癌症、糖尿病等)与高水平的氧化还原酶表达相关。其中赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)和NAD(P)H：醌氧化还原酶1[NAD(P)H：quinone oxidoreductase 1，NQO1]在多种肿瘤中的浓度明显升高。

LOX是一种调控肿瘤基质的酶，通过催化胶原和弹性蛋白交联增加ECM硬度[20]，乳腺癌中的LOX促进肿瘤生长和转移。LOX与多种癌症的恶化发展有关。

NQO1与癌症密切相关，在胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、肾癌和卵巢癌等多种癌症的肿瘤细胞中上调，其水平比正常组织高50倍[21]，能催化醌类物质的双电子还原反应，是研究中常用的肿瘤治疗靶点。

2.8α-淀粉酶的病理特点 在乳腺、卵巢和肺等肿瘤组织，发现α-淀粉酶水平显著升高，尤其在乳腺肿瘤，α-淀粉酶的水平比正常组织高85倍[22]，它能水解多糖类药物载体。α-淀粉酶也存在于正常血液中，分解多糖和糖原，它能专一性断裂α-1，4-葡萄糖苷键。

2.9GGT 的病理特点 GGT 是一种膜结合酶，分布于肝、肾、胰腺等分泌活性高的脏器中，在肾细胞癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌和结直肠癌的肿瘤部位大量表达，高水平表达GGT的癌症预后不良。GGT参与GSH的代谢，在 GSH 代谢期间产生额外的ROS，而ROS 涉及调节细胞生长、增殖和凋亡的生物反应[23]。在肿瘤细胞中过表达的GGT导致 ROS 的连续产生，促进肿瘤细胞的增殖及侵袭。

与肿瘤发生发展相关的酶是癌症的诊断指标和治疗靶点，肿瘤的分布和恶化程度可以依酶的活性判断，例如ALP、PSA用于肿瘤诊断和预后，抑制LOX表达可以抑制肿瘤恶化。肿瘤部位异常的酶见表1。

表1 肿瘤部位表达异常的酶Tab.1 Abnormally expressed enzyme in tumor region

肿瘤部位异常的酶通常被设计为激发酶响应纳米药物释药的生物分子，一些在多种癌症广泛表达的酶，如MMPs和组织蛋白酶B，可用来设计广谱抗癌药；一些仅在一种肿瘤过表达的酶，如PSA，可以设计为该种癌症的专一性药物；一些酶可直接裂解纳米载体，如HAase裂解HA、sPLA2裂解脂质体和蛋白酶裂解自组装肽载体。因此，由于酶的特殊性能，酶响应纳米药物具有非常高的临床转化价值。

3 酶响应纳米药物

疾病的病灶部位(如恶性肿瘤)中过表达的酶常用来进行疾病的诊断和预后，在研究中这些酶也被用于诊疗纳米药物的设计开发，例如MMPs、组织蛋白酶B、HAase等被用来设计酶响应药物，从而对肿瘤进行精准治疗。

3.1MMPs响应纳米药物

3.1.1MMPs响应纳米药物的设计原理与特点 MMPs响应纳米药物可以解决化疗药物生物利用度低的问题。例如姜黄素(curcumin，Cur)能抗癌、抗炎、抗氧化和清除自由基，其中对肺癌的治疗效果最佳，但它有水溶性差、结构不稳定和生物膜通透性低的问题。GUO等[24]将mPEG与MMP-2底物肽和药物载体聚己内酯(polycaprolactone，PCL)连接合成mPEG-肽-PCL三元复合物，其能在缓冲液中自发形成包被Cur的单分散纳米粒Cur-P-NPs，经MMP-2作用后，在pH值=6.5时释药率达72.85%。体内实验中，实时荧光成像显示Cur-P-NPs富集在小鼠肺肿瘤部位，表明Cur-P-NPs增强Cur的靶向性和穿透性，延长循环时间，提高对肺肿瘤的抑制作用。多柔比星(doxorubicin，DOX)也是一类脂溶性化疗药物，直接服用容易产生心脏毒性。CAO等[25]合成了MMP-7响应的肽序列Nap-FFGPLGLARKRK，它在缓冲液中聚集，自组装成表面亲水、内核疏水的纳米纤维，粒径为7.0 nm，内部运载DOX，当加入MMP-7时，肽纤维迅速裂解释放DOX，粒径减小为3.0 nm，90 min内释药率最高可达80%。自组装肽有毒性低、易降解的优点，但释药时DOX容易吸附在肽段的疏水结构域，影响释药效率，因此需对肽段组成进一步优化。LIU等[26]以生物相容性良好的介孔二氧化硅纳米粒(mesoporous silica nanoparticles，MSNs)为载体，MMPs底物肽连接MSNs与牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)来封堵MSNs的孔道，制成MMPs响应MSNs运载盐酸DOX。实验中用MMP-13水解MSNs，8 h时释药率达57.9%。该载药系统对小鼠肿瘤抑制明显，且对内脏器官无明显毒副作用，有治疗过表达MMPs肿瘤的临床转化潜力。

酶响应纳米药物中的酶底物部分可根据酶对底物结构的“偏好”进行优化，从而加快酶作用释药。SARKAR等[27]将MMP-9底物肽与硬脂酸共价连接来合成脂肽，它能形成类胶原三螺旋，易被IV型胶原酶类MMP-9水解，硬脂酸链能增强螺旋程度，并使脂肽插入脂质体中。该课题组将羧基荧光素包裹入脂质体，加入MMP-9后，依荧光强度判断出脂质体迅速裂解。以纳米脂质体为载体有生物相容性、低毒性和弱免疫原性的优点，其能提高运载药物的稳定性和体内循环时间，降低血浆清除率[28-30]，但该课题组制成的脂质体载体面临体循环中药物的包裹是否稳定、暴露于表面的肽与血液分子的相互作用是否会屏蔽MMP-9的裂解位点、体内pH、温度和离子强度的变化是否会引起肽螺旋松弛，而被其他种酶裂解造成非特异性释药等问题，这些问题是临床使用的障碍，若对其改造，有望用于化疗药物或造影剂的输送。

3.1.2MMPs响应纳米药物可用于基因治疗 肿瘤的基因治疗是将治疗性基因插入质粒(pDNA)，经载体导入癌细胞，达到阻止癌细胞生长、转移、复发的目的。VEIMAN等[31]利用细胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPP) 运送pDNA至细胞内，其中亲水改性的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)可被MMP-2作用后断裂。该药物最大的优点在于可根据患者癌症部位的实际MMPs浓度，设计不同长度PEG链的纳米药物。KOGURE等[32]制成了一种用于基因治疗的的多功能纳米载体(multifunctional envelope-type nano device，MEND)，它是一种PEG化脂质体。在临床使用中，PEG化脂质体(隐形脂质体)能避免血清蛋白识别和网状内皮系统网状内皮系统(reticulo-endothelial system，RES)摄取，且PEG的空间位阻作用能避免脂质体聚集，从而增强脂质体的稳定性，循环半衰期能延长至9～16 h[33]，但隐形脂质体常常面临“PEG窘境”，即PEG链影响靶细胞对脂质体的摄取、妨碍脂质体的核内体逃逸，为解决此问题，该课题组对MEND进行优化，加入PEG-MMP-2底物肽——二元醇磷脂酰乙醇胺(DOPE)三元复合物(PPD)[34]，使MEND在高浓度MMP-2的肿瘤间质断裂底物肽段释放PEG。由于MMP-2底物肽与脂质的相互作用影响PEG的灵活性，从而影响脂质体长循环，他们用PEG-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)部分取代PPD，并保持PEG修饰脂质的量固定在总脂质的15%，从而平衡了该纳米脂质体长血液循环和有效细胞转染的需求。

3.1.3MMPs响应纳米药物可用于细胞治疗 细胞治疗是将基因工程细胞或干细胞等治疗性细胞注射进患者体内，来替换、修复或增强受损组织或病变器官的疗法，但细胞注射时剪切应力和体循环过程中免疫排斥使细胞治疗面临挑战。YANG等[35]将PEG化的阳离子和阴离子明胶在静电作用下，通过层层自组装方法(layer-by-layer self-assembly，LBL)包裹在细胞表面，形成多层均匀明胶，将MMP-7的肽底物序列中Cys残基与PEG化的马来酰亚胺经点击反应连接，加固明胶层。用此方法合成聚合物纳米壳，能使被包埋细胞长时间保持活性，并能抵抗外力和血液循环时的免疫作用。该策略使治疗性细胞在过表达MMP-7肿瘤组织原位释放，一定程度上解决细胞治疗中细胞稳定性问题。

MMPs一般裂解Gly残基与Leu残基或Iie残基间的肽键[27]，因此其底物肽的氨基酸组成和肽链长度有一定变化空间，可灵活选择与底物肽偶联的载体。大多数报道的MMPs响应纳米药物常利用MMP-2与MMP-9。许多递药系统修饰PEG以实现长循环，但PEG长期服用引起细胞毒性和免疫反应，因此，MMPs响应抗肿瘤纳米药物在临床转化中需要优化载体。另外，虽然MMPs在多种肿瘤间质过表达，但患者肿瘤部位的MMPs依癌症类型和时期出现变化，用药时需对药物的设计策略进行调整。综合来看，MMPs是一种非常有价值的癌症治疗靶点，MMPs响应纳米药物有潜力开发为广谱抗肿瘤药物。

3.2组织蛋白酶B响应的纳米药物

3.2.1组织蛋白酶B响应纳米药物的设计原理与特点 组织蛋白酶B响应纳米药物可以以肿瘤间质为治疗位点。LEE等[36]设计了组织蛋白酶B响应药物ATF-IONP-Gem，其中抗胰腺肿瘤的化疗药物吉西他滨(gemcitabine，Gem)与氧化铁纳米粒(iron oxide nanoparticles，IONP)经组织蛋白酶B的底物肽连接，uPA通过N端序列ATF也连接在IONP上。uPA能靶向肿瘤细胞和肿瘤间质成纤维细胞表面的高浓度uPA受体(uPAR)。该纳米药物经注射后能高水平富集在胰腺肿瘤，由uPAR介导进入细胞，破坏肿瘤间质细胞，从而提高化疗药物在实体瘤中的渗透率，增强治疗效果。体内实验显示ATF-IONP-Gem对人胰腺癌移植瘤小鼠的抑瘤率(50%)高于Gem单独的抑瘤率(30%)，另外，它能增强磁共振成像(MRI)信号，可检测药物输送、治疗效果和耐药性。组织蛋白酶B响应纳米药物也可用MSNs作载体，CHENG等[37]制成了纳米MSNs输送DOX，其中烷氧基硅烷化合物和α-环糊精(α-CD)形成的轮烷结构封堵MSNs孔道，组织蛋白酶B的底物肽修饰轮烷结构末端加固密封。MSNs进入肿瘤细胞后，经组织蛋白酶B破坏封堵结构，释放DOX。细胞实验中纳米MSNs的24 h释药率达80%，显示出较高的细胞毒性和抑瘤作用。

3.2.2组织蛋白酶B响应纳米药物可用于光动力治疗(photodynamic treatment，PDT) PDT是一种非常有前景的微创疗法，它利用光敏剂受激光照射后可产生活性氧不可逆地杀死肿瘤细胞来进行抗肿瘤治疗。AI等[38]制成了用于PDT的上转换纳米粒(Upconversion nanoparticles，CRUNs)，它以掺杂La系Nd3+的上转换纳米结晶为核心，外部连接聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、细胞毒性光敏剂二氢卟吩(chlorin e6，Ce6)、PEG和组织蛋白酶B的底物肽序列Ac-FKC(StBu)AC(SH)-CBT。瘤内注射CRUNs，进入肿瘤细胞的CRUNs经组织蛋白酶B水解表面肽段，暴露出Cys残基，它与周围CRUNs的表面肽段的CBT基团共价缩合，引发CRUNs的共价交联。在波长为808 nm的近红外光照射下，这种酶引发的CRUNs交联增强光的上转换，发射更强的可见光，放大可见光对Ce6的激活作用，从而使Ce6产生更多的细胞毒性单线态氧(1O2)，增强PDT效果。波长808 nm激光的组织穿透性强，可用于追踪药物的体内位置，或判断PDT治疗效果。临床上可将这种CRUNs与其他疗法联合使用，从而对组织蛋白酶B过表达的肿瘤进行诊疗。

组织蛋白酶B在多种癌症的肿瘤细胞内过表达，响应该酶的纳米药物适用于治疗多种癌症。但由于其为胞内酶，纳米载体需进入细胞才能释放药物，借助肿瘤细胞表面受体介导的内吞作用是一种提高疗效的方法。组织蛋白酶B响应纳米药物相比胞外酶响应药物，只在细胞内产生毒性，减少药物在局部环境中释放的毒副作用，是一种非常有价值的治疗靶点，因此，运载胞内作用的抗肿瘤药物(如DOX)的纳米载体常被设计为组织蛋白酶B响应性纳米药物。

3.3HAase响应纳米药物

3.3.1HAase响应纳米药物的设计原理与特点 HAase响应纳米药物可以提高抗肿瘤药物氟尿嘧啶(fluorouracil，Fu)的生物利用度。Fu是一种嘧啶类似物，是治疗乳腺癌、胶质母细胞瘤、结肠癌等多种癌症的广谱抗癌药物，它主要作用于胸苷酸合成酶，干扰DNA合成[39]；但该药物存在严重系统毒性，且血浆半衰期短。JIANG等[40]合成了运载Fu的HAase响应MSNs(HA/FMSN)用HA作为MSNs的封端结构，肿瘤细胞表面高浓度CD44与HA结合，介导HA/FMSN内吞。细胞实验测得HA/FMSN的IC50值(1.08 μg·mL-1)远小于游离Fu(6.89 μg·mL-1)，对结肠癌移植瘤小鼠的抑瘤效果是游离Fu的3倍，显著提高了Fu的治疗效果，大大降低系统毒性。HAase响应纳米药物也被设计成双载体双靶向来提高抗肿瘤效果。JIANG等[41]设计了联合递药系统Gelipo，其包含脂质体内核和HA交联外壳，脂质体表面嵌有阳离子CPP，内部携带DOX，HA包裹脂质体，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL在HA与脂质体之间的腔内。Gelipo入血后通过EPR效应和靶向CD44作用聚集在肿瘤，经高浓度的HAase水解HA交联外壳，释放TRAIL，它与死亡受体DR4、DR5结合引发Caspase级联反应诱导细胞凋亡；释放的脂质体经CPP介导进入细胞，释放DOX引发肿瘤细胞死亡。运载TRAIL和DOX的 Gelipo细胞毒性比仅运载DOX的Gelipo高5.9倍，对乳腺癌移植瘤小鼠也表现出良好的抗肿瘤效果。Gelipo能实现顺序和位置特异性递药(sequential and site-specific delivery，SSSD)，具有极高的抗癌疗效和低系统毒性，有临床转化潜力，并且可依癌症类型改变Gelipo的表面配体分子，从而用于多种癌症治疗。

3.3.2HAase响应纳米药物可以用来监控药物释放行为 ZHENG等[42]制成一种近红外光双发光纳米载体，该载体以上转换纳米粒子UCNPs为核心(US)(λem=660 nm，λex=980 nm)，大孔二氧化硅(macroporous silica，DS)包裹细胞毒性细胞色素C蛋白(Cyt C)和US，外部用交联HA层包裹保护，并命名Cyt C-US@DS@HA。DS掺杂有荧光染料(λem=710 nm，λex=660 nm)，其吸收光谱与US发射光谱重叠。注射该药物后，在血清中DS与US因荧光淬灭而不发出荧光，当进入肿瘤组织后，HAase降解HA，释放Cyt C和US，在980 nm外源光照射下，US的上转换发光使DS发出荧光，通过检测波长710 nm荧光可监测药物释放。该纳米药物输送系统可实时监测药物的输送，这对于优化纳米药物的设计和研究药物输送途径有重要价值。

靶向HAase的载药系统往往以HA作为载体，HA有天然无毒、能靶向肿瘤细胞表面CD44受体的优势。多种癌症的肿瘤组织中高水平的HAase水解HA，使HAase响应纳米药物原位释物，但HAase水解纳米载体HA产生的小分子HA片段可能会促进肿瘤恶化，以HA为载体的HAase响应纳米药物还需要进一步研究和优化。

3.4sPLA2响应纳米药物

3.4.1sPLA2响应纳米药物的设计原理与特点 sPLA2响应脂质体比空间稳定脂质体(sterically stabilized liposomes，SSL)的载药性能更好。1995年美国食品药品管理局(FDA)首次批准的纳米药物脂质体DOXIL®可治疗晚期卵巢癌、多发性骨髓癌以及艾滋病并发的卡波西肉瘤，但其临床使用中释药缓慢，MOCK等[43]制成运载DOX的sPLA2响应脂质体SPRL，并将它们与运载DOX的SSL(类似DOXIL)比较，发现SPRL的DOX细胞摄取量是SSL1.5～2倍，对人前列腺移植瘤模型，SPRL比SSL输送药物效率高，抑瘤效果明显好于SSL，有望用于前列腺癌和其他sPLA2过表达肿瘤治疗。由于SPRL与临床使用的SSL仅存在10%DSPE的差异，而且DSPE是一种大量存在细胞膜的天然磷脂，因此，SPRL有望成为临床使用的脂质体的组成成分。

酶响应脂质体易出现脂质体酶解和药物释放不同步的现象，且脂质体常面临药物泄露问题[44]。将带有羧酸基团的亲脂性抗癌药共价连接在磷脂的sn-2位，合成前药，再以这种前药制成脂质体，在sPLA2水解后释放抗癌药物和细胞毒性的溶血磷脂[即抗癌醚脂(antitumor ether lipids，AELs)]，能解决上述问题。PEDERSEN等[45]将抗肿瘤药物苯丁酸氮芥共价连接到不同磷脂的sn-2位上，发现带有负电荷磷脂酰甘油头基、sn-1位为C16酯链的苯丁酸氮芥磷脂前药，可在缓冲液中形成单分散单层囊泡(small unilaminar vesicles，SUVs)，粒径为104 nm，在sPLA2水解后释药最快，2 h后粒径<5 nm，细胞实验中IC50值远小于苯丁酸氮芥自身IC50值，说明苯丁酸氮芥与sPLA2水解产生的AELs协同发挥抗肿瘤作用。该课题组用同样方法，分别制成了连接有抗结肠癌、前列腺癌以及乳腺癌功效的全反式维甲酸的脂质体[46]和连接抗白血病的前列腺素的脂质体[47]，这些脂质体都有较好的sPLA2响应性和抑制肿瘤细胞生长作用。另外，药物也可以连接在磷脂的sn-1位。LINDEROTH等[48]将辣椒素的羟基共价连接到甘油磷脂sn-1位上制成前药，其在缓冲液中分散后能自发形成结构稳定、表面均匀的脂质体囊泡，加入sPLA2IIA后，脂质体的磷脂sn-2位酯基水解，产生的羟基与sn-1位酯基发生环化反应形成五元内酯，释放辣椒素，24 h释药率达到90%。该纳米载药输送系统中磷脂经酶解发生环化而释药的设计原理，对于开发sPLA2响应脂质体有启发作用。

3.4.2小结 sPLA2响应纳米载药输送系统的设计中，sPLA2IIA是最常用亚型，它对阴离子脂膜水解作用强，其他sPLA2亚型对阴离子脂膜和两性脂膜均有水解作用[49]。sPLA2对酯链短、带有负电荷磷脂酰甘油或磷脂酰乙醇胺基团的磷脂更敏感，在脂质体中加入适当组分的该磷脂可提高释药效率。此外，介导sPLA2下调的sPLA2受体(PLA2R1)也介导sPLA2敏感脂质体的细胞摄取[50]。sPLA2响应脂质体具有高靶向性和良好的释药效率，其中直接共价连接脂溶性药物的脂质体在sPLA2作用后释放药物和AELS协同抗癌，疗效更好，具有很高的临床转化潜力，但其局限于脂溶性化疗药物，可用药物范围还需进一步扩大。

3.5ALP响应纳米药物

3.5.1ALP响应纳米药物的设计原理与特点 ALP响应纳米药物可设计为以细胞器为治疗靶点的纳米药物。WANG等[51]合成了ALP响应自组装肽序列FFYK，其修饰有靶向线粒体基质的三苯基膦(triphenylphosphine，TPP)，药物进入细胞后定位在线粒体，使线粒体内环境失衡释放细胞色素C，激活caspase级联反应导致癌细胞死亡。体内试验中，FFYK可选择性杀死人骨肉瘤细胞(Saos2)，没有ALP存在时，即使高浓度的FFYK依然不产生细胞毒性。该药物是靶向肿瘤细胞器的药物，相比其他靶点的药物有最小的获得耐药性。

3.5.2ALP响应纳米药物可应用于光热治疗(photothermal therapy，PTT) PTT是一种利用光热材料(photothermal agents，PTAs)转换外部光源为高温从而杀死肿瘤细胞的疗法，有无创、精准和容易控制的特性。吲哚菁绿(indocyanine green，ICG)是一种FDA批准的染料，可作为光热材料、光声成像分子和荧光探针[52]。HUANG等[53]设计了ALP响应的PTT药物，以短肽NapFFKYp为载体，肽经ALP去磷酸化后能自组装成纳米纤维，用来输送ICG。瘤内注射ICG和NapFFKYp，肽经高浓度ALP作用后自组装，ICG经头-尾排列作用(J-aggregtes)被包裹进纳米纤维，聚集的ICG经波长808 nm近红外光照射后出现红移，近红外吸收增强，热转换也随之增强，根据ICG发出的荧光可区分肿瘤组织和非肿瘤组织。体内实验中，注射4 h后，纳米纤维ICG的肿瘤摄取量比游离ICG高25倍，肿瘤组织的药物浓度是外周正常组织的15倍，纳米纤维输送ICG有效避免ICG被肾和脾的RES摄取。该药物已在实验中成功完全消除移植瘤小鼠的肿瘤，有改善光声成像和增强PTT疗效的作用，但使用时需要ICG与肽分别瘤内注射，增加患者治疗过程中的痛苦，且仅适用浅表层肿瘤。

自组装肽在输送抗肿瘤化疗药物方面极具临床转化潜力，许多研究中用ALP底物肽设计自组装肽，经ALP去磷酸化作用激发肽的自组装。但ALP在正常组织广泛存在，且许多非癌变因素也引起ALP的水平变化，因此ALP响应药物经常通过瘤内注射使用。

3.6PSA响应纳米药物 PSA响应纳米药物的设计原理与特点：PSA响应纳米药物专一地用于治疗前列腺肿瘤。前列腺癌生长缓慢、隐匿性强，转移性前列腺癌的主要治疗方法是抗雄激素疗法，但它导致患者体内雄激素剧烈下降，造成多系统失衡，若长期治疗，副作用极大。环磷酰胺是一种烷基化抗肿瘤药物，具有广谱抗癌活性。 JIANG等[54]将PSA底物肽SSFY与4-氨基环磷酰胺分子连接，当加入PSA时迅速裂解释药，这样的分子可作为酶激活的前体药物，提高环磷酰胺生物利用度。虽然该药物还处于研究初期，但它能大大降低环磷酰胺的治疗剂量，有望成为治疗前列腺癌的药物。

前列腺特异性膜抗原(PSMA)也是前列腺癌治疗靶点。XIANG等[55]制成了PSA和PSMA双靶向脂质体，脂质体表面修饰叶酸(folic acid，FA)和PSA反应肽，FA可被前列腺肿瘤过表达的细胞膜糖蛋白PMSA识别结合，PSA反应肽包括阳离子CPP(聚Arg)、PSA底物结构域(HSSKYQ)和屏蔽CPP的阴离子肽段(DGGDGGDGGDGG)，脂质体内负载沉默polo样激酶1(PLK-1)基因的siRNA，该基因表达下调会使细胞凋亡。静脉注射该药物后，EPR效应和FA配体的靶向作用使药物富集在前列腺肿瘤部位，高水平的PSA裂解PSA反应肽，去除聚阴离子结构域的屏蔽作用，激活CPP结构域，CPP和PMSA介导的内吞作用协同使脂质体进入细胞，诱导细胞凋亡。该合成策略用双靶向原理提高脂质体靶向特异性，在小鼠体内疗效显著，提高抗前列腺癌疗效。

PSA仅在前列腺特异性表达，且仅在前列腺有酶活性。前列腺癌专一性PSA控释药物大大降低药物在其他部位的非特异靶向，提高药物专一性治疗的效率。

3.7氧化还原酶响应纳米药物

3.7.1LOX响应纳米药物的设计原理与特点 以LOX为靶向的纳米药物通过抑制LOX活性治疗乳腺肿瘤。水溶性抗体LOXAB可抑制LOX活性，减缓肿瘤生长转移，但治疗剂量的LOXAB往往导致系统毒性，KANAPATHIPILLAI等[16]制成纳米药物LOXABNPs，将LOXAB连接到聚乳酸-羟基乙酸-PEG(PLGA-b-PEG-COOH)纳米共聚物表面，输送LOXAB到肿瘤ECM的LOX，该药物在乳腺移植瘤小鼠模型中抑瘤作用显著，有效剂量是游离LOXAB的1/50，且有不易产生耐药性的优点。

3.7.2NOQ1响应纳米药物的设计原理与特点 NOQ1响应纳米药物被用来提高化疗药物的生物利用度。GAYAM等[56]制成了NOQ1响应MSNs，MSNs表面用α-环糊精和二甘醇形成的轮烷结构封堵，轮烷结构外侧连接苯醌，MSNs内部负载DOX。肿瘤部位的高水平NOQ1催化苯醌还原为氢醌，使轮烷结构的“链”自动断开，释放DOX。细胞实验显示，MSNs与细胞孵育4 h，加入NOQ1后释药迅速，体内试验中，负载DOX的MSN-NQO1第17天抑瘤明显，远好于DOX单独的治疗效果有一定临床使用价值。

氧化还原酶在氧化应激中起着中心作用，是重要的治疗靶点。除了化疗，在抗肿瘤治疗中，葡萄糖氧化酶也可用来进行肿瘤的饥饿疗法[57]，同样能产生高疗效。因此，氧化还原酶是一类非常有价值的肿瘤治疗靶点。

3.8α-淀粉酶响应纳米药物 α-淀粉酶响应纳米药物的设计原理与特点：α-淀粉酶响应纳米药物可用来输送化疗药物。LI等[58]以羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)为载体，制成α-淀粉酶和GSH双重响应的纳米药物HES-SS-PTX来输送紫杉醇(paclitaxel，PTX)。静脉注射后，血液中的α-淀粉酶水解 HES的糖苷键，HES-SS-PTX粒径逐渐减小，这有利于其在肿瘤的深层穿透和富集，进入细胞后，细胞内高浓度GSH断裂二硫键，释放出游离PTX。该药物的抗肿瘤效果(63.6%)高于Taxol®(52.4%)，相比易引起超敏反应和神经毒性的PTX类药物Taxol和 Abraxane®，HES-SS-PTX毒副作用小，有很高的医用价值。

α-淀粉酶响应纳米药物可通过抑制细胞增殖的信号通路来抑制肿瘤生长。磷脂酶A2(PLA2)是一种抗癌蛋白，通过与表皮生长因子受体(EGFR)作用抑制表皮生长因子EGF与EGFR的结合。FERGUSON等[59]用磷脂酶A2连接糊精制成纳米药物，使其活性降低36%，糊精在肿瘤组织中被高水平的α-淀粉酶降解，磷脂酶A2活性完全恢复，磷脂酶A2抑制细胞增殖，发挥抑瘤作用。这种纳米药物有抗乳腺癌作用，但长期服用可能产生耐药。

α-淀粉酶在乳腺肿瘤中高水平表达，常被用来开发酶响应药物治疗乳腺癌。α-淀粉酶可降解HES、糊精、葡聚糖等天然多糖载体，适合作为酶响应抗肿瘤纳米药物的内源刺激。

3.9GGT响应纳米药物 GGT响应纳米药物的设计原理与特点：GGT响应纳米药物能解决药物在实体瘤中难以渗透扩散的问题。肿瘤组织的血管分布杂乱，肿瘤间质和肿瘤细胞致密，瘤内渗透压高，导致仅依靠被动扩散的纳米药物难以渗透到血管远端肿瘤细胞。ZHOU等[60]制成了运输抗肿瘤药物喜树碱(camptothecin，CPT)的长循环纳米共聚物，它由单体2-(L-Y-谷氨酰-L-α-氨基丁胺)乙基丙烯酰胺(BEAGA)-CPT组成，其中CPT通过二硫键连接到BEAGA。在体循环中，聚2-(L-Y-谷氨酰-L-α-氨基丁胺)乙基丙烯酰胺(PBEAGA)-CPT为电中性，到达肿瘤血管时，血管的管腔内皮细胞表面密集的GGT作用脱去γ-谷氨酰胺，产生氨基，使共聚物表面阳离子化而吸附于内皮细胞，进行吸附介导的跨细胞转运(adsorption-mediated transcytosis，AMT)进入肿瘤间质，也有一部分PBEAGA-CPT通过EPR效应渗入肿瘤，同时肿瘤细胞表面大量的GGT介导药物进行AMT转运，PBEAGA-CPT在相邻细胞间内吞和外排，从而相对均匀地分布在实体瘤，进入细胞的PBEAGA-CPT经GSH断裂二硫键释放CPT。体内试验中，该药物能消除50 mm3的大肿瘤，抑瘤率高达99%，它将药物在瘤内的运输由被动扩散转变为主动渗透，解决了EPR效应渗透率低的问题，克服了高压导致药物在瘤内运输难的障碍，具有非常高的临床转化价值。

GGT作用后的肽产生电荷翻转，大大提高药物进入细胞的效率，但依靠GGT介导药物输送易引起耐药性，且不适合GGT异质肿瘤，治疗中可与其他疗法结合。

酶响应纳米药物可结合多种疗法，输送不同种类的治疗剂或成像剂，经内源性酶激活进行精准诊疗，是一种疗效高、可塑性极强的载药系统。酶响应纳米药物总结见表2。

表2 酶响应纳米药物的设计策略Tab.2 Design strategy of enzyme responsive nanomedicine

酶响应纳米药物降低了药物副作用，有望实现肿瘤精准治疗。sPLA2释放共价连接磷脂药物的设计策略中，纳米脂质体的水解产物AELs与化疗药物协同抗肿瘤，相比普通载药系统，纳米药物释药迅速，抗肿瘤疗效增强；依靠受体介导的内吞作用进入细胞的药物，长期使用容易使受体下调产生耐药，通过电荷翻转来增加细胞对药物的亲和力是一种行之有效的方法；另外，肿瘤细胞表面GGT介导药物跨细胞转运的策略很大程度上解决了EPR效应介导药物入瘤效率低和实体瘤渗透难的问题；对于载体，自组装肽载体有低毒、易降解的优点，具有很高的临床应用价值。需注意的是，异质性肿瘤的酶分布不均匀，不同微环境的治疗效果出现差异，这是酶响应纳米药物面临的一大问题，治疗中需要与其他疗法结合，更有效的抗肿瘤疗法还需进一步研究。

4 结束语

酶响应纳米药物是由内源性生物催化剂激活的纳米药物，与被动靶向纳米药物相比，在靶部位的富集浓度更高、治疗效果更好和毒副作用更低；不同肿瘤或同一种肿瘤的不同发展时期，酶种类和水平不同，这是患者个性化给药的依据。

尽管酶响应纳米药物具备诸多优点，但鲜有临床转化成功的案例，在后续的酶响应药物研发中需关注以下几个问题：① EPR效应输送药物效率低且不稳定。酶响应纳米药物首先需要通过EPR效应进入肿瘤，但EPR效应在肿瘤间存在差异，例如前列腺肿瘤、胰腺肿瘤相比肝细胞肿瘤与肾细胞肿瘤的血管密度低，EPR效应较弱；另外，在血管同一部位的不同时期EPR效应不同；收缩压、凝血等因素也会影响EPR效应[5]。因此，高效地输送药物需要开辟其他途经，研究发现肿瘤血管的内皮细胞有囊泡-空泡细胞器(vesiculo-vascuolar organelles， VVOs)结构，它横跨细胞质，由大量相互连接的胞质囊泡组成，一些小分子药物可通过这些囊泡跨细胞转运[61]，若充分开发该途径，将其与EPR效应协同作用，可大大提高递药效率。②非病灶部位的酶易引起酶响应纳米药物释药。许多肿瘤部位异常的酶在正常组织中也广泛存在(如ALP)，且同一家族酶的底物类似，这会引起药物在非靶部位释放。为使酶响应药物只作用于病灶部位，还需发现更优的肿瘤特异性酶。③酶响应纳米药物的设计应关注该酶催化反应动力学。酶反应时间和反应程度都影响药物释放速度和治疗效果，可根据酶催化动力学优化给药剂量。④纳米药物易被RES摄取。90%纳米药物在给药后都被RES摄取，为逃逸RES的清除，纳米药物的水合直径需远大于15 nm，另外可用红细胞膜包裹纳米粒来遮蔽调理素，抑制吞噬细胞的识别作用[4，62-63]。⑤人与小鼠的生理不同易使药物临床转化失败。目前纳米药物的开发过度依赖小鼠，但小鼠体内环境、酶组成与人不同，这使移植瘤小鼠和人使用相同药物后，产生不同的疗效，例如小鼠和人的酯酶活性不同，小鼠酯酶响应的抗肿瘤药不适用于对人治疗[64]，因此还需要进一步研究。⑥多种刺激响应纳米药物不稳定。多种刺激响应纳米药物的制备和治疗机制较为复杂，一种刺激的缺失可能导致药物治疗失败，需要在活体模型动物规律用药的情况下连续长时间观察效果，并对单一刺激缺失时的疗效和毒性进行评估。