HBV-ACLF患者肝脏B7-H6的表达水平与肝损伤的相关性

袁青?杨小安?兰天云?邹勇

【摘要】目的 探討HBV相关慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）患者肝组织自然杀伤细胞天然细胞毒性受体NKp30特异性配体B7同源物6（B7-H6）的表达水平与肝损伤的相关性。方法 收集HBV-ACLF患者肝移植术中切除的肝组织（HBV-ACLF组）及CHB患者（CHB组）肝穿刺标本各18例，并以5例来源于肝脏血管瘤切除标本旁的正常肝组织为正常对照组。利用免疫组织化学染色检测3组肝组织中B7-H6的表达水平。分析肝组织B7-H6表达水平及与肝损伤程度（总胆红素水平）的相关性。结果 B7-H6主要表达在肝细胞，而且多在肝小炎症反应强烈区域内。定量分析显示，HBV-ACLF组肝组织B7-H6表达的平均相对密度（127.02±40.25）高于轻度CHB组（22.08±10.82）和正常对照组（14.26±5.67）（P均< 0.05），轻度CHB组与正常对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。HBV-ACLF患者肝脏B7-H6水平与血清总胆红素水平呈正相关（rs = 0.604，P < 0.05）。结论 肝脏B7-H6高表达可能是NKp30/B7-H6被激活导致HBV-ACLF免疫性肝损伤加剧，肝细胞大量凋亡和坏死的重要因素。

【关键词】乙型肝炎病毒;肝衰竭;自然杀伤细胞;B7同源物6

Correlation between the expression level of hepatic B7-H6 and liver injury in HBV-ACLF patients

Yuan Qing， Yang Xiaoan， Lan Tianyun， Zou Yong. Department of Blood Transfusion， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Zou Yong， E-mail： zouyong0205@ 163. com

【Abstract】Objective To investigate the correlation between the expression level of hepatic B7 homologue 6 （B7-H6） and liver injury in patients with hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure （HBV-ACLF）. Method Needle biopsy liver tissues and resected liver tissue samples during liver transplantation were obtained from patients with mild chronic hepatitis B （CHB） and HBV-ACLF patients， respectively. Normal liver tissues from 5 cases of hemangioma were utilized as normal controls. The expression levels of hepatic B7-H6 were quantitatively measured by immunohistochemical staining. The correlation between the expression of B7-H6 and the degree of liver injury （total bilirubin level） was analyzed. Results B7-H6 was mainly expressed in liver cells， especially in the area with intense hepatic inflammatory responses. Quantitative analysis demonstrated that the average relative density of B7-H6 expression in the HBV-ACLF group was （127.02±40.25）/lpf， significantly higher compared with （22.08±10.82）/lpf and （14.26±5.67）/lpf in the mild CHB and normal control groups （both P < 0.05）. No statistical significance was noted between the mild CHB and normal control groups （P > 0.05）. In the HBV-ACLF patients， the B7-H6 expression level was positively correlated with the serum total bilirubin level （rs = 0.604， P < 0.05）. Conclusion High expression of hepatic B7-H6 is probably a critical factor leading to aggravation of immunity-mediated liver injury induced by NKp30/B7-H6 activation， the apoptosis and necrosis of a large quantity of liver cells in HBV-ACLF patients.

【Key words】Hepatitis B virus;Liver failure;Natural killer cell;B7 homologue 6

HBV相关慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）是终末期肝病的常见模式，在慢性乙型肝炎（CHB）或HBV相关性肝硬化患者中经常发生。HBV-ACLF是在CHB基础上出现的急性或亚急性肝功能失代偿， 临床表现为黄疸和凝血障碍、失代偿性腹水、 伴或不伴有肝性脑病[1-2]。其病情严重且发展迅速，病死率可高达45% ～ 90%，目前以肝移植为主要治疗手段，但是绝大部分患者预后不良。目前认为，HBV-ACLF的发病是病毒和宿主双方共同作用的结果，其中细胞免疫介导的肝细胞损伤在HBV-ACLF的发病中发挥着关键作用。因此，深入研究HBV-ACLF细胞介导的肝损伤机制对降低肝衰竭患者的病死率及改善预后有着重要意义。笔者前期在HBV-ACLF的研究已经证实，NK细胞在HBV-ACLF患者肝脏大量募集，外周血NK细胞表面天然细胞毒性受体（NCR）NKp30和NKp46表达增强，肝脏NK细胞pKP30的表达亦增强，提示HBV-ACLF肝细胞的大量坏死与肝脏NK细胞的过度激活以及NCR的应激表达密切相关[3]。本研究通过检测HBV-ACLF患者肝组织NKp30特异性配体B7同源物6（B7-H6）的表达水平，探讨B7-H6的应激表达与肝细胞损伤的相关性，为阐明HBV-ACLF的发病机制及寻找新的分子靶点提供理论依据。

材料与方法

一、标本来源及分组

收集2013年1月至2015年6月在我院肝移植手术切除的HBV-ACLF肝组织标本及行肝穿刺活组织检查（活检）确认为轻度慢性乙型肝炎（CHB）的肝组织标本。纳入标准：HBV-ACLF患者须符合《肝衰竭诊治指南（2012年版）》的HBV-ACLF诊断标准，CHB患者须符合《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》相关诊断标准。排除合并其他肝炎病毒或HIV、酒精性肝炎、药物性肝病、脂肪性肝病、自身免疫性疾病者。共收集了18例轻度CHB肝组织（轻度CHB组）、18例HBV-ACLF肝组织（HBV-ACLF组），并以5例来源于肝脏血管瘤切除标本旁的正常肝组织为正常对照组。本研究方案已获得中山大学附属第三医院伦理委员会的批准，患者均已签署知情同意书。

二、主要仪器与试剂

使用日本日立7170A型全自动生化分析仪进行检测。主要试剂包括兔抗人B7-H6多克隆抗体（Abcam，美国）、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔二抗（Kyoto，日本）、二氨基联苯氨（DAB）工作液（Kyoto，日本）。

三、研究方法

1. 临床资料的收集

记录标本来源患者的性别、年龄，肝穿刺或肝移植手术前各项生化指标如ALT、AST、总胆红素、凝血酶原时间、凝血酶原活动度和HBV DNA水平等。

2. 免疫组织化学染色（免疫组化）

将5 μm石蜡切片脱蜡至水后用pH 6.0的0.01 mmo/L枸橼酸钠缓冲液进行抗原修复。用0.03%过氧化氢/硝酸钠处理阻断内源性过氧化物酶，10%正常兔血清室温覆盖组织30 min以阻止非特异性染色。滴加50 μl （1∶50） 兔抗人B7-H6多克隆抗体于切片上，37℃湿盒孵育1 h。Tris-HCl缓冲液冲洗后，加入50 ～ 100 μl HRP标记羊抗兔二抗孵育30 min，再加入DAB工作液，镜下观察显色情况，蒸馏水冲洗终止显色。利用Image-Pro Plus 7.0对肝脏B7-H6表达进行半定量分析。每张免疫组化切片随机选取6个200倍视野，以每个视野阳性区域的光密度总和除以阳性区域的面积总和得出表达的平均相对密度值。

四、統计学处理

利用SPSS 21.0进行统计学分析。非正态分布的计量资料采用中位数（下四分位数，上四分位数）表示;正态分布的计量资料以表示，组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。计数资料用例（%）或相对比表示。肝组织B7-H6与血清总胆红素、ALT、AST及HBV DNA的关系采用Spearman秩相关分析。P < 0.05为差异具有统计学意义。

结果

一、轻度CHB组、HBV-ACLF组和正常对照组的一般资料

3组标本来源患者的一般资料见表1。

二、轻度CHB组、HBV-ACLF组和正常对照组肝组织B7-H6的表达比较

B7-H6主要表达在肝细胞，而且多在肝小炎症反应强烈区域内。定量分析显示，3组肝组织B7-H6表达的平均相对密度差异有统计学意义（F = 73.731，P < 0.001）。HBV-ACLF组肝组织B7-H6表达的平均相对密度（127.02±40.25）高于轻度CHB组（22.08±10.82）和正常对照组（14.26±5.67）（P均< 0.05），轻度CHB组与正常对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05），见图1。

三、肝组织B7-H6的表达水平与肝损伤的相关性分析

HBV-ACLF患者肝组织B7-H6表达水平与血清总胆红素水平呈正相关（rs = 0.604，P = 0.008），B7-H6的表达水平与血清ALT、AST及HBV DNA水平均无关（P均> 0.05）。

讨论

NCR包括NKp30、NKp44、NKp46，是近年发现的一类非MHV限制的特异性启动NK细胞活化的新颖活化受体。NCR在NK细胞杀伤包括神经母细胞瘤、黑色素瘤、白血病等多种肿瘤细胞以及流感病毒、副流感病毒、EB病毒等多种病毒感染细胞中发挥着关键作用。现有研究表明，NCR在抗HBV及 HCV感染、肝癌中发挥着重要作用。在慢性HCV感染中，NK细胞表面NCR NKp46和NKp30表达下调，这可能是NK细胞效应功能被抑制，病毒持续感染的重要机制[4]。聚乙二醇干扰素α-2b治疗CHB，对IFN产生应答的CHB患者NK细胞NKp30的表达增强，其与HBV载量降低有关，研究表明NKp30在NK细胞抗HBV感染中发挥着重要作用[5-6]。一项最新的研究表明，肝癌患者肿瘤浸润NK细胞NKp30的表达及其配体B7-H6在肝癌组织的表达与肝癌的发生发展密切相关[7]。

NCR需要与肿瘤细胞或病毒感染细胞上特异性配体识别后才能发挥效应功能，然而寻找NCR配体的研究进展缓慢，直至2009年，美国Levin等才证实，B7家族免疫受体成员B7-H6是NK细胞活化受体NKp30的配体。B7-H6在正常人体组织中不表达，但在一些肿瘤细胞中表达上调[8]。近年进一步的研究表明，B7-H6或可溶性B7-H6在某些体外或体内炎症条件下可被诱导表达[9]。为探讨在HBV-ACLF高度炎症状态下肝脏B7-H6能否被应激诱导以及NKp30/B7-H6信号通路在HBV-ACLF免疫介导肝细胞损伤中的作用，本研究收集HBV-ACLF患者肝移植手术切除的肝组织及CHB患者肝穿刺标本并通过免疫组化对肝组织B7-H6的表达进行了检测和比较。结果显示，与CHB患者相比，HBV-ACLF患者肝组织B7-H6表达上调，而且与肝细胞损伤程度（总胆红素水平）呈正相关，表明NKp30/B7-H6相互作用在活化NK细胞介导肝细胞损伤中可能发挥着重要作用。

综上所述，B7-H6在HBV-ACLF患者肝组织中表达上调，其应激表达与HBV-ACLF患者肝细胞损伤的严重程度呈正相关，这将为深入研究HBV-ACLF肝损伤机制提供新的分子靶点和思路。

参 考 文 献

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（收稿日期：2020-04-21）

（本文編辑：林燕薇）