建立一种实时荧光PCR对维生素D受体基因单核苷酸多态性快速分型

李胜涛 陈 磊 徐玉娟曹 红周丹旎彭小友，*

维生素D(Vitamin D，VD)是一种拥有广泛生理功能的激素和营养素，不仅影响钙-磷代谢和骨组织矿化，还与糖尿病、心血管疾病、免疫性疾病及肿瘤等密切相关[1]。学龄前是儿童骨发育关键时期，易发生 VD 缺乏而导致各种骨源性疾病，如佝偻病、骨质疏松、代谢综合征[2]等，许多流行病学研究显示[3-5]，VD缺乏在儿童中普遍发生，约有30—40%的儿童存在不同程度的VD缺乏，而钙浓度则往往正常，低水平的VD则会影响钙的吸收。提示需对儿童进行血液VD监控，对不足人群进行VD补充将有助于预防VD缺乏相关疾病的发生。既往研究提示VD不同补充剂量对生理的意义呈现山峰型，即低剂量对体内VD浓度改变不大，而高剂量可能对身体造成危害，引起VD中毒[6]，因此需要对VD的剂量进行个体化的调整，有研究[7，8]发现VD个体剂量与维生素D受体(VDR)基因多态性密切相关。过去几年里，有其它多种用于VDR基因多态性检测的方法，如限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、单链构象多态性、变性高效液相色谱、高分辨熔解曲线[9]等。虽然这些方法准确可靠，但存在操作耗时费力，试剂消耗昂贵等问题，限制了其广泛应用。本文初步建立了一种扩增阻滞突变系统(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)PCR快速检测VDR基因rs2228570、rs1544410、rs7975232位点多态性的方案，特异性好，操作方便，现报道如下。

1 材料与方法

1.1试剂和仪器

人全血DNA小量提取试剂盒(产品编号3001250，杭州新景生物试剂开发有限公司)，NovoStart®SYBR qPCR SuperMix Plus(货号E096，近岸蛋白质科技有限公司)，7500 FAST实时荧光PCR仪(赛默飞)，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，序列如表1。

表1 qPCR引物序列

1.2检测样本来源及处理

本院体检正常的11例健康儿童，于清晨采集静脉血3ml，置入枸橼酸钠抗凝管中，使用人全血DNA小量提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行全血DNA提取。并利用微量分光光度计对其浓度及纯度进行检测。本研究经本院医院伦理委员会审核报备通过。

1.3ARMS-qPCR基因分型

反应总体系20μl，其中SYBR qPCR SuperMix预混型试剂10μl，引物(20μM)各0.4μl，50×ROX-Dye 0.4μl，DNA模板2μl，超纯水补齐至20μl。每例DNA模板同时在两个反应管中进行，分别用引物对上游引物/野生型下游引物和引物对上游引物/突变型下游引物进行扩增。采用传统的三步法对VDR SNPs进行实时PCR。rs7975232反应条件：95℃ 30s预变性；95℃ 5s，60℃ 30s， 72℃ 30s扩增40个循环，每一个循环在72℃收集荧光信号。rs1544410反应条件：95℃ 30s预变性；95℃ 5s，64℃ 30s， 72℃ 30s扩增40个循环，每一个循环在72℃收集荧光信号。rs2228570反应条件：95℃ 30s预变性；95℃ 5s，54℃ 30s， 72℃ 30s扩增40个循环，每一个循环在72℃收集荧光信号。每个反应设置3个复孔。

1.4扩增产物测序

扩增产物送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序分析。方法简述如下，商品化试剂盒(货号DK005，近岸蛋白质科技有限公司)纯化PCR产物，并构建PCR体系，50ng PCR产物，2μl的BigDye，3μl的BigDye缓冲液，测序引物1μl，用无菌超纯水补足20μl体系，扩增条件：96℃1min，96℃10s，50℃5s，60℃4min，25个循环，4℃保温。反应结束后，在PCR反应管中加入2μl 125mmol/LEDTA和2μl 3mol/L醋酸钠(pH5.2)到管底，再加入50μl 100%无水乙醇,短时振荡后，室温避光放置15min。4℃12 000rpm离心30min，弃上清，加150μl预冷70%乙醇，4℃12 000rpm离心10min，弃上清。加入10μl Hi-Di Formamide，溶解DNA，溶解后的样品在定性PCR仪上95℃变性5min，迅速置冰中冷却4min后，变性DNA加入至与基因分析仪配套的96孔板，进行测序反应，仪器自动输出测序结果。

2 结 果

2.1rs7975232 ARMS-PCR结果及测序分型结果

VDR基因的rs7975232位点分型结果如图1，该位点有三种基因型,即CA型、AA型和CC型，CA型杂合子模板可以同时被野生型-VDR-rs7975232-R引物和突变型-VDR-rs7975232-R引物扩增出产物，且扩增效率一致，ARMS-PCR分型结果与测序分型结果一致(图1A)；AA型纯合子模板被野生型-VDR-rs7975232-R引物和突变型-VDR-rs7975232-R引物均扩增出产物，但突变型-VDR-rs7975232-R引物扩增效率更高，ARMS-PCR分型结果与测序分型结果一致(图1B)；CC型纯合子模板被野生型-VDR-rs7975232-R引物和突变型-VDR-rs7975232-R引物均扩增出产物，但野生型-VDR-rs7975232-R引物扩增效率更高，ARMS-PCR分型结果与测序分型结果一致(图1C)。

图1 ARMS-PCR对VDR基因的rs7975232位点分型

2.2rs1544410 ARMS-PCR分型结果及测序分型结果

VDR基因的rs1544410位点分型结果如图2所示，该位点共检出一种基因型，即CC型，野生型-VDR-rs1544410-R引物和突变型-VDR-rs1544410-R引物均扩增出产物，ARMS-PCR分型结果与测序分型结果一致。

图2 ARMS-PCR对VDR基因的rs1544410位点分型

2.3rs2228570 ARMS-PCR分型结果及测序分型结果

VDR基因的rs2228570位点分型结果如图3所示，该位点有三种基因型,即GG型、AA型和GA型，GG型纯合子模板被野生型-VDR-rs2228570-R引物和突变型-VDR-rs2228570-R引物均扩增出产物，但突变型-VDR-rs2228570-R引物扩增效率更高，结果一致(图3A)；AA型纯合子模板被野生型-VDR-rs2228570-R引物和突变型-VDR-rs2228570-R模板均扩增出产物，但野生型-VDR-rs2228570-R引物扩增效率更高，ARMS-PCR分型结果与测序分型结果一致(图3B)；GA型杂合子模板可以同时被野生型-VDR-rs2228570-R引物和突变型-VDR-rs2228570-R引物扩增出产物，且扩增效率一致，ARMS-PCR分型结果与测序的基因分型结果一致(图3C)。

图3 ARMS-PCR对VDR基因的rs2228570位点分型

3 讨 论

VD对个体的免疫系统有重要影响，它既可以调节先天免疫又可以调节适应性免疫，还可以调节炎症级联反应。一项汇集了11 321名参与者的Meta分析显示，补充VD可降低所有受试者急性呼吸道感染的风险，且对VD缺乏患者效果更明显[11]，Bergman等[12]纳入了11项共涉及5 660人的随机安慰剂对照试验结果显示，补充VD显著降低了呼吸道感染的风险。 反复呼吸道感染患儿存在25-羟维生素D3和免疫球蛋白功能降低的情况，在进行VD补充后，可以使患儿机体免疫力明显提高，发生呼吸道感染的几率显著降低[13]。

VD补充剂量所产生的效果与VDR基因多态性密切相关。VD通过肝肾代谢转化为有活性的1,25-(OH)2-D3后与VDR结合发挥生理功能[14]。VDR为亲核蛋白，属于类固醇激素/甲状腺激素受体超家族成员，是介导 1，25-(OH)2-D3发挥生物效应的关键受体[15]。VD主要生物学功能都是通过 VDR介导调节靶基因转录来实现，VDR本质上是一种配体依赖的核转录因子，它在维持机体钙-磷代谢，调节细胞增殖、分化等方面起重要作用[16]。应用PCR-RFLP研究发现，VDR基因序列上存在多个内切酶酶切位点，证实了VDR基因具有明显的多态性，到目前为止，至少有25个VDR多态性位点被发现，其中Bsm I、Apa I、Taq I、Fok I这4个位点被普遍认为是影响VDR相关疾病发生风险主要位点，与骨代谢、免疫、肿瘤等密切相关[17]。不同区域的多态性位点对VDR基因表达产生的影响不同，Bsm I 和Apa l酶切位点位于第VIII内含子上，其多态性不影响VDR的氨基酸序列[18]；Fok I酶切位点位于转录起始部位 ，其多态性可导致氨基酸序列长度发生改变。总体来说，C-端启动子区内的多态性位点影响mRNA的表达方式和表达水平，而N-端非翻译区的多态性位点则影响mRNA的稳定性和蛋白质的翻译效率，并且这种影响与其所在的细胞类型、分化阶段和活性状态有关。

目前SNP检测方法主要包括：TaqMan 探针方法、变性高效液相色谱法(DHPLC)技术和质谱分析、单链构象多态性分析(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)、DNA 芯片、高温连接酶法、SNaPshot 法、高分辨率熔解曲线法(HRM)、DNA 测序法。这些方法因其设备试剂昂贵、操作繁琐原因，不适用于一般常规实验室开展VDR基因检测。VRMS-PCR是一种用来检测已知突变位点，根据已知突变位点设计3条引物，其3，端碱基分别与突变型和野生型模板碱基互补，从而将有某种突变点的模型与野生型模板区分开来，该方法操作简单、成本低，能弥补上述检测方法的不足。但是对于未知位点的突变则不能用该方法进行检测。

本实验方法利用VRMS-PCR快速检测VDR基因rs2228570、rs1544410、rs7975232位点多态性，直接探测基因扩增过程中荧光信号的变化，获得定量结果具有高特异性和精确性， 操作简便、速度快或可用于临床VDR基因SNP快速分型。◀