TGF-β1对口腔癌相关成纤维细胞在二维和三维共培养条件下迁移的影响

杨津， 吴飞飞， 高庆红， 李小玉， MANABU Kato， 程然， 周红梅

1. 口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医院口腔黏膜病科，四川成都（610041）； 2. 四川大学华西口腔医院口腔颌面外科，四川 成都（610041）； 3.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医院，四川 成都（610041）； 4. 三重大学医院肾内科，日本 三重县（514-8507）； 5.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医院预防科，四川 成都（610041）

癌相关成纤维细胞（carcinoma associated fibroblasts，CAFs）是肿瘤微环境中最重要的间质细胞，在肿瘤的发生发展过程中扮演关键角色［1-2］。本课题组前期研究结果显示：与正常成纤维细胞相比，口腔CAFs 无论在形态结构、生长方式、分泌特性、染色体核型还是基因型等方面均发生了显著变化，而正是这类生物学特性异常活跃的CAFs 促进了口腔癌的发生发展［3-5］。被募集迁移至癌巢区域是CAFs 重要的生物学特性之一［6-7］，但有关口腔CAFs 是否发生迁移，目前仅有本课题组前期在二维培养条件下观察到的初步结果［8］。因二维细胞模型较难准确模拟体内环境［9］，因此，有必要建立三维细胞模型观察CAFs 的迁移现象，为进一步研究转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）对CAFs 的迁移调控机制奠定实验基础，本研究拟通过二维和三维细胞共培养模型探讨TGF-β1 对CAFs 迁移的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料

倒置荧光相差显微镜（Olympus 公司，日本）；青链霉素双抗（HyClone，美国）；10%胎牛血清（Gibco，美国）；高糖型DMEM 培养基（Gibco，美国）；胰蛋白酶（HyClone，美国）；波形蛋白（vimentin）兔抗人单克隆抗体（Abcam，英国）；成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP）兔抗人多克隆抗体（Abcam，英国）；α-平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）兔抗人单克隆抗体（Abcam，英国）；细胞角蛋白（cytokeratin）兔抗人多克隆抗体（Abcam，英国）；生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒（索莱宝，中国）；polybrene（汉恒生物）。

1.2 标本收集及口腔CAFs 原代细胞分离培养

经患者知情同意，选取2014～2016 年在四川大学华西口腔医院颌面外科收集的新鲜口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）组织块。将组织置于含有青链霉素双抗的PBS 缓冲液中备用。本实验经四川大学华西口腔医院医学伦理委员会审查通过。用青链霉素双抗和PBS 冲洗组织块，眼科剪剪切至1～3 mm3大小，均匀地排列在瓶底，相互距离约0.5 cm。10%胎牛血清高糖型DMEM 培养基注入培养瓶底部，置于37 ℃，5%CO2孵箱中培养。待组织块周围爬出的细胞铺满培养瓶底90%时，胰蛋白酶消化。传代2 次纯化CAFs。用第3 代纯化细胞做鉴定。具体方法参照本课题组前期建立的组织块法［10］。

1.3 免疫细胞化学染色鉴定

细胞成单层铺于盖玻片上后，用4%多聚甲醛溶液固定细胞。PBS 漂洗后，用0.1%TritonX-100 处理细胞。采用生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒进行免疫细胞化学染色。一抗包括波形蛋白（vimentin）兔抗人单克隆抗体、成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP）兔抗人多克隆抗体、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）兔抗人单克隆抗体和细胞角蛋白（cytokeratin）兔抗人多克隆抗体，PBS 作为阴性对照。于倒置相差显微镜下观察，将胞质中出现淡棕色或棕黄色颗粒判为阳性结果。

1.4 二维培养：细胞划痕实验和Transwell 小室实验

1.4.1 分组 未经处理的CAFs 细胞为对照组，以培养基中加入10 ng/mL TGF-β1 刺激的CAFs 为实验组。

1.4.2 细胞划痕实验 6 孔板中接种1 × 106个CAFs 培养24 h 至铺满，饥饿24 h 后，用10 μL 的枪尖划线3 条、冲洗；分别加入含10 ng/mL TGF-β1 的和不含TGF-β1 的无血清高糖型DMEM 培养基培养；分别取0 h、24 h、48 h 后观察、采图。

1.4.3 Transwell 小室实验 Transwell 小室实验中，Transwell 下室加入500 μL 含0.5%胎牛血清的培养基，实验组下室中加入外源性刺激因子10 ng/mL TGF-β1；上室加入200 μL 密度为2 × 105个/mL 的CAFs 细胞混悬液。培养24 h 后，取出小室，冲洗，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，光镜下观察计数。

1.5 制备绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）（+）CAFs

CAFs 细胞计数1.5×106个后培养24 h，换1 mL新鲜培养基和5 μg 的polybrene。每瓶中加入4.5× 107IU 慢病毒溶液进行转染，慢病毒质粒中插入GFP 片段和平阳霉素抗性基因片段。培养24 h 后换为含10 ng/mL 平阳霉素的新鲜培养基，筛选稳定表达GFP 的细胞，同时，向空白组的CAFs 中加入同等量的平阳霉素，隔天换液培养。待空白组的CAFs 全部死亡后，将GFP（+）细胞培养液换为无平阳霉素的含10%胎牛血清的培养基。

1.6 三维细胞共培养模型的建立

借助GFP（+）CAFs 对现有的三维细胞迁移模型进行改进，建立了肿瘤细胞和CAFs 迁移的三维细胞培养模型（图1），该模型中，基质胶上方为口腔癌细胞株SCC25，基质胶分为上下层，上层为GFP 标记的CAFs，下层为无标记的CAFs，以方便观察上层CAFs 向下层的迁移。

Figure 1 Establishment of a three-dimensional culture model for the migration of CAFs and squamous carcinoma cells. Created with BioRender.com图1 建立肿瘤细胞和CAFs 迁移的三维细胞培养模型

三维培养体系基质成分按照表1 的比例混合，放于冰上备用，制备为组织基质。吸取CAFs 与上述配制的基质混匀，取100 μL（细胞数5 × 105个/mL）加入96 孔板中，置于37 ℃，5% CO2孵箱孵育0.5 h，待基质凝固，制备为下层间质组织；GFP（+）CAFs 与基质混匀，取100 μL（细胞数5 × 105个/mL）加入96 孔板中基质的上层，37 ℃，5%CO2孵箱孵育0.5 h 后，制备为上层间质组织，加入100 μL培养基，再培养24 h。在制备好的间质组织上种植肿瘤细胞，吸取SCC25 细胞混悬液100 μL（细胞数2×105个/mL）加入96 孔板中，培养24 h。

表1 三维培养体系基质成分Table 1 Proportion of gel components

用I型胶原浸泡尼龙膜，置于孵箱中孵育30 min后，用含1%戊二醛的PBS 固定［11］，置于4 ℃冰箱中1 h 后PBS 和培养基交替冲洗，浸泡于培养基中，4 ℃储存备用，制备尼龙膜。取出96 孔板中已凝结成组织块的三维细胞培养模型放至培养皿尼龙膜上，浸泡含10%胎牛血清的培养基，培养1 周。隔天换液。实验组的培养皿中的培养基中加入外源性10 ng/mL TGF-β1，对照组中不加入TGF-β1，以比较TGF-β1 对口腔癌细胞和CAFs 细胞迁移的影响。培养1 周后4%多聚甲醛固定24 h，脱水机中脱水，液体蜡包埋后切片。组织切片行HE 染色：将组织切片放入二甲苯中脱蜡，然后置于梯度酒精中进行水化，于苏木素染液中染色水洗，1%盐酸酒精分色，置于伊红染液中染色，梯度酒精脱水，置于二甲苯中透明，中性树胶封片。分别置于普通光学显微镜、荧光显微镜下观察采图。

1.7 统计学分析

所有数据采用SPSS 21.0 软件统计分析，采用非参数检验中的K-S 检验方法对两组数据进行正态性检验，若数据资料服从正分布，则采用studentt检验；若数据资料不服从正态分布，则采用秩和检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 CAFs 的原代培养和鉴定

原代培养的CAFs 5 d 可见组织块周围有少量细胞爬出，细胞呈长梭形。原代培养的3 株细胞的细胞角蛋白表达均呈阴性，波形蛋白表达均呈阳性，说明细胞来源于间质，而非来源于上皮。

α-SMA 和FAP 常作为鉴定CAFs 的标志蛋白，染色阳性表达（图2），说明培养的细胞为CAFs［12］。

Figure 2 Immunocytochemistry staining to identify CAFs ×40图2 CAFs 免疫细胞化学阳性结果 ×40

2.2 二维培养培养条件下口腔CAFs 的迁移

2.2.1 细胞划痕实验结果 在对照组中，24 h 时可观察到细胞的迁移，48 h 细胞迁移数增多，划痕宽度变小；在实验组中，24 h 时细胞迁移数较对照组多，48 h 时划痕基本愈合（图3a）；24 h（t=3.595，P=0.023）和48 h 时（t=19.24，P＜0.001，图3b），两组间的平均划痕宽度的差异有统计学意义。

2.2.2 Transwell 小室实验结果 Transwell 小室实验中观察到了CAFs 的迁移现象，加入外源性TGFβ1 刺激因子24 h 后，实验组中平均细胞迁移数达到122 个，而对照组平均细胞迁移数59.33 个，实验组明显较对照组增多（图3c、3d）。两组间的平均细胞迁移数的差异有统计学意义（t=8.132，P=0.001，图3e）。

2.3 三维细胞培养条件下肿瘤细胞和CAFs 迁移的观察

用慢病毒转染制备的GFP（+）CAFs，慢病毒转染率达到了90%以上。借助GFP（+）CAFs 建立了肿瘤细胞和CAFs 迁移的三维细胞培养模型。结果发现，普通光镜下可发现明显的肿瘤上皮层和细胞间质层，肿瘤上皮细胞向间质明显浸润（图4a）；在荧光显微镜观察，可发现图中GFP（+）的CAFs 分布在基质胶的全层中，即整个间质层中可观察到GFP 标记的CAFs，提示GFP（+）的CAFs 向下层胶中发生了迁移（图4b）。

Figure 3 Comparison of the two-dimensional cell culture model formigration between the two groups图3 两组间二维细胞培养迁移结果的比较

Figure 4 Observation of the three-dimensional culture model for migration图4 三维细胞共培养模型的迁移结果观察

在实验组细胞培养基中加入TGF-β1，HE 染色后，进行比较（图5a），结果示实验组平均浸润深度/三维细胞培养组织全层深度的比值约0.436，对照组约0.433，两组间肿瘤细胞平均浸润深度比差异无统计学意义（t=0.03，P=0.977，图5b）；荧光成像比较GFP（+）CAFs在间质层的迁移，发现GFP（+）CAFs已迁移至未标记CAFs 细胞层（图5c），且10 ng/mL TGF-β1对CAFs细胞迁移深度也无明显影响。

3 讨 论

Figure 5 Comparison of the three-dimensional cell culture model for migration between two groups图5 两组间三维细胞培养迁移结果的比较

目前CAFs 研究大多采用二维模型，即划痕实验和Transwell 小室实验［5-6，13］。二维培养条件较难模拟体内环境，缺乏与肿瘤细胞、细胞间基质的相互作用，与体内CAFs 真实生存环境有一定差异［14］。为了能更好地模拟体内环境，研究者们模拟出三维共培养模型［15-16］，Horie 等［17］通过建立上皮细胞-CAFs 三维共培养模型，用以研究肺癌细胞与CAFs 间的作用，在组织培养5 d 后，组织切片后可看到上皮细胞的浸润。Ham 等［9］通过三维基质-三阴性乳腺癌细胞培养，方便地模拟CAFs 与三阴性乳腺癌细胞的相互作用，量化其对癌细胞信号传导和耐药的影响。Bertero 等［11］应用了由成纤维细胞诱导的鳞状细胞癌细胞集体侵袭的三维模型。Nakamura 等［18］利用三维培养模型发现平足蛋白（+）CAFs 对肺腺癌肿瘤细胞的促生长作用。三维模型与Transwell 小室等其他共培养体系相比较，实验结果更加直观，且更接近真实环境［19］。课题组对现有的三维共细胞迁移模型进行了改进，以更直观地观察口腔CAFs 的迁移现象。三维培养通过肿瘤上皮层和基质层的建立，能模拟体内的肿瘤微环境，研究肿瘤细胞与CAFs 间的相互作用。本实验中通过对基质分层、上层细胞标记后，可以更加直观地观察到CAFs 的迁移。

TGF-β1 作为肿瘤细胞和CAFs 之间相互作用的重要细胞因子［20-21］，既可促进肿瘤的发展［22］，也可加强CAFs 的迁移能力。在TGF-β1 调控下，结肠癌CAFs 中的连接蛋白claudin-11 表达上调，可促使CAFs 集中迁移［23］。旁分泌的TGF-β1 在CAFs 诱导的上皮间质转化和乳腺癌细胞转移中起重要作用［22］。并且TGF-β1 的相互旁分泌作用可增强CAFs 诱导的癌细胞侵袭［6-7］。本实验在二维培养条件下，通过细胞划痕实验、Transwell 小室实验观察到了CAFs 的迁移现象，并证实了TGF-β1 可促进CAFs 的迁移。但三维共培养模型中，未发现TGFβ1 对肿瘤细胞和CAFs 迁移的明显影响。二维培养和三维培养需要的TGF-β1 的浓度有差异，三维共培养模式下梯度渗透［16］后，细胞直接接触的TGF-β1 浓度相较于二维培养接触的浓度低，不同的培养方式提示TGF-β1 对细胞迁移的效应呈浓度依赖性。本实验结果也说明二维培养模拟体内具有局限性，三维培养更接近于真实情况，TGF-β1在真实的肿瘤微环境中对CAFs 迁移是否起到作用，还有待进一步研究。

综上所述，使用肿瘤细胞、CAFs 以及胶原建立的三维模型能良好地模拟体内肿瘤微环境的组成、结构和形态，可以更好地模拟肿瘤微环境，模拟体内环境下CAFs 的迁移。三维模型为研究肿瘤微环境中各组分的相关关系［24］，模拟细胞迁移、细胞生物力学［25］、肿瘤细胞侵袭浸润［26］、药物干预等［27］提供了实验条件。