余甘子提取物抗氧化能力分析和对酪氨酸酶活性的影响

于丽娟，吴丽华，王金香，李雪瑞，田 浩，杨 芳，李晚谊，肖 丹，李智敏*

(1.云南省农业科学院农产品加工研究所，云南 昆明 650221；2.云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650205；3.山西大同大学生命科学学院，山西 大同 037009)

【研究意义】余甘子(PhyllanthusemblicaL.;P.emblica),又名滇橄榄，为大戟科叶下珠属落叶乔木或灌木，被世界卫生组织列为在世界范围内推广种植的3种保健植物之一；广泛分布于中国、印度、印度尼西亚和马来西亚等热带和亚热带地区，其中云南省是中国余甘子野生资源的主要分布区[1]。余甘子果实富含多种人体有益物质，如多酚、黄酮、多糖、维生素、有机酸等[2]，因此不仅能清热凉血、消食健胃、生津止咳，同时还具有抗炎、降脂、降压、免疫调节、抗氧化等多种药用功效[3]。【前人研究进展】多酚和黄酮类化合物是余甘子的主要功效成分，不但与余甘子果实提取物的抗氧化活性密切相关，还与其大部分药理作用如抗病原微生物、抗炎、调节免疫，抗衰老等密切相关[3-4]。从天然植物中提取多酚和黄酮类物质，利用其抗氧化、抗衰老等活性，开发功能性食品和日用品具有广泛的应用前景[5]。【本研究切入点】作为富含多酚和黄酮类物质的药食两用资源，余甘子极具开发价值和市场潜力，但余甘子目前仍存在开发利用率低、产品附加值不高的问题。【拟解决的关键问题】文章以余甘子果实为材料，采用水提法和乙醇提法提取其中的有效成分，分析其抗氧化活性分析和对酪氨酸酶活性的影响，探究余甘子的功效；研究结果进一步确认了余甘子果实富含多酚和黄酮类活性物质，且水提物优于醇提物；同时明确了余甘子果实提取物具有极强的抗氧化能力，对DPPH自由基的清除能力最强，对羟自由基的清除能力最弱；而且研究发现余甘子果实提取物可影响酪氨酸酶活性，低浓度提取物引起酶活性升高，高浓度则抑制酶活性，但作用机制比较复杂有待进一步研究。研究结果可为促进余甘子果实的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

余甘子果实清洗后去核烘干，研磨成粉末后过筛，得到干粉；L-DOPA(L-多巴)，酪氨酸酶(25KU)，DPPH(1,1-苯基-2-苦肼基自由基)，ABTS(2,2联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)，均从上海源叶生物科技有限公司采购；30 % H2O2，过硫酸钾和水杨酸等试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器

电子分析天平(梅特勒-托利多，ME204)；电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司，DK-98-Ⅱ)；超声仪(昆山超声，KQ5200E)；酶标仪(Thermo Scientific，MULTISKAN GO)；离心机(Eppendorf，5424 R)等。

1.3 方法

1.3.1 余甘子水提物的制备 取余甘子果实干粉，按料液比1∶8(m/V)加入蒸馏水，沸水回流提取1 h，离心过滤后取上清液，如此重复提取2次，将2次滤液合并，干燥后得到余甘子水提物。

1.3.2 余甘子醇提物的制备 取余甘子果实干粉，按料液比1∶8(m/V)加入95 %乙醇，回流提取1 h，离心后取上清液，反复提取2次后将滤液合并，干燥后得到余甘子醇提物。

1.3.3 供试液制备 余甘子提取物经超声辅助溶解后，稀释至适当浓度用于测定多酚和黄酮含量，分析其对DPPH、ABTS+、羟自由基的清除能力和对酪氨酸酶活性的影响。

1.3.4 多酚含量的测定 采用福林酚法测定余甘子果实提取物中多酚含量[6]。采用没食子酸为标准品，绘制标准曲线：横坐标为没食子酸质量浓度(μg/mL)，纵坐标为760 nm处吸光值，得回归方程：y=4.6529x+0.0015(R2=0.9991)。经适当稀释后取50 μl样品，加入200 μl蒸馏水和250 μl福林酚，室温反应8 min；加入20 % Na2CO3750 μl，混匀；加入400 μl 蒸馏水避光反应1.5 h，于760 nm处检测吸光值，代入标准曲线计算反应液中多酚的含量。

1.3.5 黄酮含量的测定 采用紫外分光光度法测定黄酮含量。采用芦丁为标准品，绘制标准曲线：以芦丁浓度(μg/mL)为横坐标，以505 nm处吸光值为纵坐标，得回归方程：y=0.0019x+1.244(R2=0.998)。经适当稀释后取2 mL样品，加入1 mL 5 % 亚硝酸钠，摇匀、反应6 min；再加入10 % 硝酸铝1 mL，反应6 min；加入4 % NaOH 4 mL、80 %乙醇2 mL，定容至10 mL，反应15 min，测505 nm处吸光值。代入标准曲线计算反应液中黄酮的含量。

1.3.6 DPPH清除能力测定 样品经适当稀释后，取100 μl，加入2.0×10-4mol/L DPPH 溶液100 μl，混匀，常温反应1 h后，测定 517 nm 处吸光值，记为AS；DPPH 溶液在 517 nm 处的吸光值记为A1；各样品自身在517 nm 处的吸光值记为A0。按公式I(%)=[1-(As-A0)/A1]×100 计算样品对DPPH的清除率。

1.3.7 ABTS+清除能力测定 利用7 mmol/L ABTS 和 2.45 mmol/L 过硫酸钾在避光室温条件下反应 12～16 h， 制备ABTS+；用无水乙醇稀释，测 734 nm 处吸光值，至吸光值为 0.7±0.05时备用。

取经适当稀释后的样品50 μl，加入200 μl ABTS+溶液，混匀、室温避光反应6 min后，测定734 nm处吸光值，记为AS；ABTS+溶液于734 nm 处的吸光值记为A1；各样品自身于 734 nm 处的吸光值记为A0。按公式I(%)=[1-(As-A0)/A1]×100 计算样品对ABTS+的清除率。

1.3.8 羟自由基清除能力测定 分别加入 9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L 水杨酸-乙醇和样品各1 mL后，加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2用于启动反应，37 ℃水浴反应15 min，测定反应液在510 nm处的吸光值，记为As；同时测定各样品自身于510 nm的吸光值，记为A0；空白溶液于510 nm的吸光度值，记为A1；按公式I(%)=[1-(As-A0)/A1]×100，计算样品对羟自由基的清除率。

1.3.9 酪氨酸酶活性抑制动力学检测 酪氨酸酶活性的检测采用酪氨酸酶-多巴速率氧化法。按表1所示，将PBS磷酸盐缓冲液、稀释至适当浓度的样品、酪氨酸酶混合均匀；37 ℃孵育10 min后，加入100 μl L-多巴溶液混匀。以PBS缓冲液为对照，连续反应30min、检测溶液在 475 nm 处的吸收值，得到AC1、AC2、AT1和AT2。计算样品对酪氨酸酶活性的抑制作用，计算公式如下：

表1 酪氨酸酶活性测定反应液

活性抑制率(%)=[1-(AT1-AT2)/(AC1-AC2)]×100

式中，AC1: 不加样品、加酪氨酸酶的反应液的吸光值；AC2:不加样品、也不加酪氨酸酶的反应液的吸光值；AT1: 同时添加样品、酪氨酸酶的反应液的吸光度；AT2: 加样品、但不加酪氨酸酶的反应液的吸光值。

1.3.10 生物统计学分析 所有测试均重复3次，以平均值±平均偏差的方式表达结果；同时采用 SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 余甘子提取物中多酚和黄酮含量的检测

多酚和黄酮类物质都含有酚羟基，可溶于水、乙醇等溶剂中[7]。因此用水或乙醇为溶剂从植物中提取多酚和黄酮类物质是常用方法。本实验分别以水和乙醇为溶剂从余甘子果实中提取多酚和黄酮。如表2所示，以水为溶剂从余甘子果实中提取多酚含量可达到22.95 mg/g DW，而以乙醇为溶剂可提取多酚为15.61 mg/g DW，水提法得到的余甘子多酚含量是醇提法的1.47倍。采用水提法提取黄酮类物质含量为34.61 mg/g DW，醇提物中的含量是17.61 mg/g DW，水提物得到的黄酮是醇提法的1.96倍。以水为溶剂提取的多酚和黄酮含量均高于乙醇，推测余甘子中水溶性多酚和黄酮含量高于醇溶性多酚和黄酮。

表2 余甘子提取物中多酚和黄酮类化合物的含量

2.2 余甘子提取物对3种自由基的清除率

多酚和黄酮类物质均具有抗氧化活性，可清除机体中的自由基，增强机体的抗氧化能力，提高机体的抗衰老能力[8-10]。本实验采用水提法和醇提法从余甘子果实中提取多酚和黄酮类物质，并对其自由基清除能力进行了分析。结果(表3)表明，无论是水提物还是醇提物对3种自由基都表现出极强的清除能力，其中余甘子水提物和醇提物清除DPPH的IC50值分别为4.58和5.62 μg/mL；余甘子水提物和醇提物清除ABTS+的IC50值分别为9.61和14.29 μg/mL；水提物和醇提物清除羟自由基的IC50值分别为1.99和5.02 mg/mL。水提物对3种自由基的清除能力高于醇提物；并且提取物对3种自由基清除能力大小依次是DPPH>ABTS+>羟自由基，对DPPH自由基的清除能力最强，对羟自由基的清除能力最弱。

表3 余甘子提取物对DPPH、ABTS+、羟自由基的清除能力

2.3 相关性分析

同时本文分析了余甘子果肉提取物中多酚、黄酮类化合物含量与其自由基清除能力的相关性。如表4所示，多酚、黄酮类化合物含量均与其DPPHIC50值呈显著负相关关系，相关性在-0.80以上；与ABTS+和羟自由基IC50值均表现出极显著负相关，相关性在-0.95以上。表明多酚类和黄酮类化合物是余甘子清除DPPH、ABTS+和羟自由基的主要功效成分，这为证实余甘子果肉富含多酚和黄酮类化合物，具有较强抗氧化能力，可进一步开发利用提供了理论依据。

表4 多酚、黄酮含量与余甘子抗氧化活性的相关性分析

2.4 余甘子提取物对酪氨酸酶活性的影响

余甘子果实提取物对酪氨酸酶活性影响的体外实验(图1)表明，不添加任何提取物时(对照组)，酪氨酸酶活性表现为：初期，酶活性迅速呈指数级上升，10 min后酶活性趋于平稳不发生明显变化；当在反应体系中加入余甘子提取物时，与对照相比酪氨酸酶活性发生改变，其中加入0.2 mg/mL提取物(低浓度组)，酪氨酸酶活性在10 min内与对照组接近，没有显著变化，但随反应时间的延长酶活性持续升高，在反应时间达30 min时高于对照；当浓度为0.6 mg/mL时(中浓度组)，在反应15 min之内对酪氨酸酶一直表现出抑制作用，之后抑制作用逐渐减弱，反应20 min之后酶活性逐渐超过对照组；当加入1.8 mg/mL(高浓度组)水提物时，在整个观察期间酪氨酸酶活性内一直被抑制，只是随反应时间延长抑制效应逐渐减弱。余甘子醇提物对酪氨酸酶活性的影响与水提物相似，即：低浓度的醇提物有激活酪氨酸酶的作用，中浓度组表现出先抑制后激活的规律，高浓度组对酪氨酸酶表现出抑制作用。分析反应15 min时水提物和醇提物对酪氨酸酶活性的影响，发现虽然由于重复之间变化较大，二者差异不显著，但与醇提物相比，水提物对酪氨酸酶活性表现出更明显的激活或抑制作用。

A：不同浓度水提物对酪氨酸酶活性的影响；B：不同浓度醇提物对酪氨酸酶活性的影响；C：余甘子水提物和醇提物对酪氨酸酶活性抑制率的比较A: The enzymatic reaction curve added with different concentration of aqueous extracts; B: The enzymatic reaction curve added with different concentration of ethanolic extracts; C: Comparison of the inhibition rate of aqueous and ethanolic extracts

3 讨 论

3.1 余甘子果实水提物和醇提物中多酚和黄酮类物质的含量

本文分别采用水提和醇提法提取余甘子果实中的有效成分，检测其中多酚和黄酮含量，进一步确认余甘子果实中存在丰富的多酚和黄酮类化合物；但由于提取溶剂不同，导致提取物中多酚和黄酮含量不同，其中水提物中多酚和黄酮类化合物均高于醇提物，水提得到余甘子果实中多酚和黄酮类含量分别为22.95、34.61mg/g DW，是醇提的1.47，1.96倍。根据多酚和黄酮类物质富含羟基的特性和相似相溶原理，采用水或极性溶剂(如乙醇和丙酮)对其进行提取，当提取溶剂的极性与余甘子中酚类和黄酮化合物极性相近时，才能更充分高效地提取活性物质[7]。本实验分别以水和95%乙醇为溶剂用煮沸回流1 h、抽提2次的方法从余甘子果实中抽提活性物质，干燥后分别得到水提物和醇提物，水提法得到的活性物质更多，抽提率更高。

3.2 余甘子果实水提物和醇提物的抗氧化活性

脂质过氧化是导致细胞衰老的主要原因。自由基(羟自由基、超氧自由基、羧自由基、一氧化氮等)能加速体内不饱和脂肪酸氧化为类脂过氧化物，加快器官的衰老[11]。凡能减少此类自由基的产生或积累，即可抑制氧化反应的发生，起到防衰老、防疾病等作用。DPPH是一种以氮为中心的自由基，样品对DPPH自由基的清除能力，可以反映其抗氧化能力[12-13]；ABTS法也是检测体外抗氧化能力的常用方法之一[14]。笔者对2种方法提取得到的余甘子果实样品分别进行了DPPH、ABTS+和羟基自由基清除能力分析。IC50值越低，表明抗氧化能力越强[15]。结果表明，水提物和醇提物对3种自由基均有很强的清除作用，其中水提物清除DPPH、ABTS+和羟自由基的IC50的浓度分别为4.58、9.61、1.99 mg/mL。研究结果与杨冰鑫(2019)[16]报道的余甘子多酚对DPPH自由基(EC50为 9 μg/mL)、羟自由基(EC50为 0.47 mg/mL)[12]的清除能力趋势一致。且本研究中水提物的抗氧化能力高于醇提物，这与水提物中多酚和黄酮含量高于醇提物的结果一致。而且本文进一步分析了余甘子果实提取物中多酚和黄酮类化合物含量与其清除自由基能力的相关性。发现多酚和黄酮，都与余甘子提取物清除DPPH、ABTS+、羟自由基的IC50值呈显著负相关，表明多酚和黄酮这两类物质是清除以上3种自由基的主要成分。但余甘子果实中的多酚和黄酮化合物种类多样、结构复杂，抗氧化能力不尽相同。推测当用2种提取试剂抽提多酚和黄酮类活性成分的时候，不仅含量不同，而且多酚和黄酮的组成结构也差异巨大，因而最终表现出不同的抗氧化能力。后期可进一步对余甘子果实中多酚和黄酮物质进行深入分离鉴定。

3.3 余甘子果实水提物和醇提物对酪氨酸酶活性的影响

酪氨酸酶是引起人体产生黑色素以及果蔬褐变的关键酶，采用酪氨酸酶抑制剂抑制酪氨酸酶活性可一定程度上减少黑色素的生成，因此酪氨酸酶抑制剂在美容、食品及医药等领域具有广阔的应用前景[17]。多酚类物质可以抑制酪氨酸酶的活性[18]。在本实验中，余甘子水提物和醇提物对酪氨酸酶的活性影响表现出浓度效应。低浓度对酪氨酸酶有激活作用，中浓度组表现出先抑制后激活的规律，高浓度则表现出抑制作用。余甘子醇提物对酪氨酸酶活性影响与水提物相似，总体趋势上醇提物的影响效果弱于水提物。余甘子提取物对酪氨酸酶活性的作用效应可能是人们利用其开发生毛、防脱发专利的基础[19-20]。基于本实验结果，推测余甘子的提取物不但富含多酚和黄酮类物质，同时含有很多其他活性成分，因此较低剂量余甘子提取物可激活酪氨酸酶，发挥黑发护发功效；较高浓度余甘子提取物则可以用于开发功能性日化品，发挥抗氧化、抗衰老作用。

4 结 论

本研究以余甘子果实为材料，采用水提法和乙醇提法提取其中的有效成分，从体外抗氧化活性和其对酪氨酸酶活性的影响，探究余甘子的功效。研究结果进一步确认了余甘子果实富含多酚和黄酮类活性物质，且水提物优于醇提物；同时明确了余甘子果实提取物具有极强的抗氧化能力，对DPPH自由基的清除能力最强，依次强于ABTS+、羟自由基；研究还发现余甘子果实提取物可影响酪氨酸酶活性，低浓度提取物引起酶活性升高，高浓度则抑制酶活性，作用机制比较复杂有待进一步分析。本研究结果可为促进余甘子果实的开发利用提供理论依据。