没食子酰芍药苷通过激活Nrf2信号通路减轻PM2.5诱导的血管内皮细胞损伤

毕静 白晓雪 王超

(1湖北省阳新县人民医院心内科，湖北 阳新 435200；2吉林大学第一医院干部病房；3淄博市第一医院 中医科)

PM2.5指环境空气中空气动力学当量直径小于2.5 μm的颗粒物，PM2.5可经过呼吸道进入血液中，引起血管内皮细胞损伤及呼吸系统相关疾病〔1，2〕。没食子酰芍药苷(GPF)是从毛崀科植物芍药中提取出的有效成分，具有抗氧化作用。既往研究发现，GPF可通过激活核因子E2相关因子(Nrf2)/血红素氧化合酶(HO)-1通路，减轻脑缺血再灌注后氧化应激和炎症反应，从而起到神经保护作用〔3〕。本研究旨在探讨GPF对PM2.5导致的血管内皮细胞损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂 人微血管内皮细胞系 HMEC-1购自美国ATCC细胞库；GPF(北京索莱宝科技)；DMEM培养基和胎牛血清(HyClone)；噻唑蓝(MTT)试剂盒(美国Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD) 试剂盒及丙二醛(MDA)试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；Nrf2抗体、GAPDH抗体、辣根过氧化物酶(HRP)、羊抗兔二抗(北京索莱宝科技)。

1.2细胞培养 复苏冻存的HMEC-1细胞，用10%胎牛血清DMEM培养液于37℃、5%CO2培养箱内培养。传至第二代，待细胞状态稳定，进入对数生长期可进行实验。

1.3实验分组与处理 (1)空白对照组：未添加任何实验药物；(2)PM2.5组(终浓度25 μg/cm2)；(3)GPF组：GPF终浓度为100 μmol/L；(4)GPF+PM2.5组：先分别加入终浓度为25、50、100 μmol/L的GPF，预处理24 h后加入终浓度为25 μg/cm2的PM2.5处理24 h。

1.4MTT测定 细胞分组后，在培养板中每孔中加入MTT 10 μl(5 g/L)，37℃孵育4 h，弃去上清液，然后以每孔150 μl二甲基亚砜(DMSO)溶解细胞沉淀，酶标仪检测492 nm每孔的吸光度。

1.5MDA和SOD测定 将细胞分组处理，分别收集培养板上的细胞和上清液，按照MDA和SOD试剂盒说明检测。

1.6Western印迹检测Nrf2的蛋白表达 将处理后的4组细胞用常温磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次，于冰上充分裂解30 min，4℃超速离心后提取细胞上清液，应用二喹啉甲酸(BCA)法测定细胞上清液中蛋白含量，取40 μg每孔上样，95℃环境热浴10 min，采用10%十二烷基硫代硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行蛋白电泳，转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，Nrf2(1∶3 000)，GAPDH(1∶10 000)4℃孵育过夜。次日，Tween-20-Tris(PBST)洗涤后用HRP标记的二抗室温孵育1 h，PBST洗涤后，电化学发光(ECL)显色。

1.7统计学处理 采用SPSS17.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1GPF对PM2.5引起的HMEC-1细胞活性的影响 空白对照组HMEC-1细胞多为梭形，边界清晰，PM2.5诱导细胞24 h后，镜下可见细胞皱缩，数量明显低于空白对照组。MTT试验结果显示，PM2.5呈剂量依赖式抑制细胞增殖，PM2.5组与空白对照组(101.0%±1.5%)相比，细胞存活率降至(44.1%±4.6%)，因此选择该浓度造模。当GPF组细胞存活率(47.6%±3.8%)较PM2.5组无明显差异，当GPF(50，100 μmol/L)预处理24 h后，与PM2.5组相比较，细胞存活率分别增加到63.3%±4.1%和82.0%±5.2%，GPF 50、100 μmol/L差异有显著意义(P<0.01)。

2.2GPF对PM2.5引起的HMEC-1细胞中MDA含量和SOD活性的影响 与空白对照组(103.5%±2.8%)比较，PM2.5组MDA含量(96.8%±3.7%)无统计学差异，GPF组MDA含量(142.6%±2.7%)明显增加(P<0.05)，而PM2.5+GPF组MDA含量(127.3%±4.2%)较GPF组显著降低(P<0.05)；PM2.5组SOD活性(98.5%±4.5%)与空白对照组(104.3%±2.2%)无统计学差异，而GPF组SOD活性(128.1%±2.8%)空白对照组明显下降(P<0.05)，PM2.5+GPF组的SOD活性与空白对照组比明显增加(P<0.05)。

2.3GPF对PM2.5引起的HMEC-1细胞Nrf2蛋白表达的影响 与空白对照组(0.91)相比较，PM2.5组和GPF组Nrf2蛋白水平(0.79、0.83)无显著差异；与PM2.5组相比，PM2.5+GPF组Nrf2蛋白表达(1.32)明显升高(P<0.05)，这表明GPF可以活化PM2.5损伤细胞的Nrf2，而对正常细胞Nrf2的活化无明显影响，如图1。

图1 4组HMEC-1细胞中Nrf2蛋白表达

3 讨 论

PM2.5颗粒对血管内皮细胞有一定的毒性作用〔4，5〕，易感染或引起其他心血管疾病。Wan等〔6〕通过发现小鼠AS斑块的形成，证实了PM2.5对心血管的生理毒性，同时也揭示了我国大气污染面临着严峻的发展形势。

文献报道，抗氧化性的植物可抑制心血管内皮细胞的损伤〔7，8〕，GPF具有抗氧化作用。Nrf2是细胞内调节氧化应激的重要转录因子，在抗炎、抗氧化、抗肿瘤等方面发挥着重要的作用，是细胞防御应激损伤的关键因子〔9〕。本文结果发现GPF可以通过激活Nrf2信号通路，对PM2.5诱导的血管内皮细胞起保护和抑制作用。