龈沟液中Shh蛋白、MMP-8与老年慢性牙周炎患者炎症程度的相关性

龚攀 曾玉 邝燕好 陈凯

(1广州医科大学附属肿瘤医院口腔科，广东 广州 510095;2广东药科大学附属第一医院口腔科)

我国牙周疾病的发病率远远高于龋病，牙周炎是牙周病中较为常见的类型，其中约95%为慢性牙周炎〔1〕。慢性牙周炎的发病率随着年龄的升高而呈现增长趋势。慢性牙周炎是由于牙周微生物在牙周定植、繁殖、入侵，损害宿主相关牙周组织，引发免疫反应，甚至导致全身炎症性反应〔2，3〕。慢性牙周炎牙龈炎症逐步向深部组织进展，造成牙周组织破坏，导致牙周袋的形成，并随着疾病的进一步发展，导致牙龈退缩、牙齿松动、牙周脓肿等一系列临床症状〔4，5〕。龈沟液主要来源于龈下菌斑、细菌、宿主代谢产物及血清，其成分的组成及量的变化可有效反映牙周组织状态〔6〕。基质金属蛋白酶(MMP)-8是牙周炎主要胶原酶，可引起Ⅰ型胶原发生降解，Ⅰ型胶原是包括牙周膜、牙龈、牙槽骨在内的牙周软硬组织的主要细胞外基质成分〔7，8〕。Sonic Hedgehog(Shh)蛋白是Hh蛋白家族成员之一，其信号通路与细胞炎症因子有关，在炎症反应的发生中具有重要作用〔9〕。本研究探讨Shh蛋白、MMP-8在老年慢性牙周炎患者龈沟液中的表达水平，分析其与炎症程度的相关性。

1 材料与方法

1.1一般资料 回顾性选取广州医科大学附属肿瘤医院2018年6月至2019年3月90例老年慢性牙周炎患者，根据牙龈指数(GI)、探诊深度(PD)、附着丧失(AL)、X 线片显示牙槽骨吸收程度(ABL)进行分组，其中轻度组29例，中度组31例，重度组30例，另选取牙周健康志愿者30例作为对照组。对照组男19例，女11例；年龄60～72岁，平均(66.92±2.71)岁；轻度组男17例，女12例；年龄61～73岁，平均(66.80±2.08)岁；中度组男20例，女11例；年龄60～74岁，平均(66.91±1.85)岁；重度组男17例，女13例；年龄60～73岁，平均(66.88±2.14)岁。四组性别与年龄无显著差异(P>0.05)。

1.2纳入标准 (1)慢性牙周炎符合《牙周病学》相关诊断标准〔10〕；(2)年龄≥60岁；(3)无与牙周炎相关的全身性疾病或慢性疾病；(4)无吸烟及酗酒史；(5)口腔存留牙≥20颗；(6)近3 个月内未使用过抗生素治疗；(7)近1年内未接受过牙周治疗。

1.3排除标准 (1)合并高血压、糖尿病、心脏疾病等；(2)侵袭性牙周炎者；(3)龈沟液收集的牙位颈部分存在龋、修复体、充填物等；(4)长时间使用激素、抗生素、免疫抑制剂；(5)正畸治疗史；(6)1年内使用过牙周药物或进行过手术治疗；(7)根尖片显示颈部无任何牙体病变。

1.4轻、中、重度牙周炎诊断与分组标准〔11〕由同一名牙周科医师进行除第三磨牙以外的全口牙周情况进行检查。检查内容：PD、AL、GI、ABL。每颗牙选择颊、舌侧正中、近中、远中检测6个位点，取平均值作为最终测量结果。 对照组：GI=0，PD≤3 mm，未出现附着丧失或牙槽骨吸收；轻度组：GI>1，PD<4 mm，AL为1～2 mm，牙槽骨ABL不超过根长1/3，牙松动现象不明显。中度组：GI>1，PD 4～6 mm，AL为3～4 mm，牙槽骨水平或角形1/3≤ABL≤1/2，牙出现轻度的松动，多根牙存在轻度的根分叉病变。重度：GI>1，PD>6 mm，AL≥5 mm，牙槽骨ABL>根长的1/2，根分叉存在明显病变，牙出现多处松动。

1.5龈沟液的采集 使用0.5 ml的无菌EP管，采用3号Whatman滤纸裁成适中大小，彻底消毒后，将每3张滤纸条放入1根Ep管，记录总重量。收集患者龈沟液，于最深的单根牙近中颊侧采集，样品均在固定时点采集，每位患者采集3份。龈沟液采集之前，需使用无菌刮匙将邻面上的龈上菌斑及牙石去除，通过气枪轻轻吹干受试牙牙面，医用棉卷隔湿。将滤纸插入牙颊侧近中牙周袋内，感受到明显的阻力后，停留约30 s，取出。若滤纸上有唾液、血渍、菌斑，则舍去重新取样。

1.6龈沟液中Shh蛋白与MMP-8的提取与检测 将含龈沟液的EP管中加入磷酸盐缓冲液(PBS)150 μl，震荡4 min，离心3 000 r/min条件下离心10 min，转移上清液至消过毒的EP管中，做好编号。通过酶联免疫吸附试验检测龈沟液中Shh、MMP-8水平。取原倍标准品150 μl进行倍比稀释，设置空白孔、标准孔、待测样品孔。酶标包被板上标准品加50 μl样品，待测样品孔首先加入40 μl样品稀释液，再加入待测样品10 μl，轻轻晃动将样品混匀。封板后置于37℃条件下温育30 min。将30倍的浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍备用。揭掉封板膜后，将液体弃除，甩干，每个孔中均加满洗涤液，静置30 s，弃去，重复5次后拍干。除空白孔外，每孔加入50 μl酶标试剂。加入显色剂 A、B各50 μl，震荡混匀，37℃条件下避光显色处理15 min，每孔加入50 μl终止液。加终止液后15 min，以空白孔调零，在450 nm波长条件下依次测定吸光度(OD 值)。标准物浓度作为横坐标，OD值作为纵坐标，绘制标准曲线，根据OD值查出相应浓度，再乘以稀释倍数，即样品实际浓度。

1.7统计学方法 采用SPSS20.0软件进行F检验、t检验，通过受试者工作特征(ROC)曲线分析预测效能，相关性采用Pearson相关性分析。

2 结 果

2.1慢性牙周炎患者与对照组Shh蛋白、MMP-8表达水平比较 慢性牙周炎患者Shh蛋白、MMP-8表达水平显著高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 慢性牙周炎患者与对照组Shh蛋白、MMP-8表达水平比较

2.2不同炎症程度患者Shh蛋白、MMP-8表达水平比较 中度组Shh蛋白、MMP-8表达水平显著高于轻度组，重度组Shh蛋白、MMP-8表达水平显著高于中度组(P<0.05)。见表2。

表2 不同炎症程度患者Shh蛋白、MMP-8表达水平比较

2.3龈沟液中Shh蛋白、MMP-8反映患者炎症程度效能分析 龈沟液中Shh蛋白、MMP-8联合检测反映患者轻度与中度炎症、中度与重度炎症ROC曲线下面积(AUC)显著高于单独Shh蛋白、MMP-8检测(P<0.05)。见表3和图1。

表3 龈沟液中Shh蛋白、MMP-8反映患者炎症程度效能分析

图1 Shh蛋白、MMP-8反映慢性牙周炎患者轻度与中度炎症、中度与重度炎症ROC曲线

2.4不同炎症程度患者牙周指数比较 轻度组GI、PD、AL、ABL显著低于中度组，中度组显著低于重度组(P<0.05)。见表4。

表4 不同炎症程度患者牙周指数比较

2.5龈沟液中Shh蛋白、MMP-8与老年慢性牙周炎患者炎症程度相关性 龈沟液中Shh水平与GI、PD、AL、ABL均呈正相关(r=0.421、0.395、0.502、0.518，均P<0.01)；龈沟液中MMP-8水平与GI、PD、AL、ABL均呈正相关(r=0.522、0.554、0.317、0.437，均P<0.01)。

2.6龈沟液中Shh蛋白、MMP-8水平的相关性 龈沟液中Shh、MMP-8水平呈正相关(r=0.469，P<0.01)。见图2。

图2 慢性牙周炎患者龈沟液中Shh蛋白、MMP-8水平相关性

3 讨 论

慢性牙周炎是一种牙周菌斑及其产物作用下牙周组织内释放炎症介质，炎症细胞浸润造成的慢性感染性疾病，主要特征为牙周袋形成、附着丧失、牙槽骨吸收、牙齿松动〔12〕。老年牙周疾病患者口腔卫生状态较差，牙龈普遍萎缩，牙周附着丧失多，牙槽骨吸收严重，牙齿松动明显，并常伴有根面暴露、根面龋、食物嵌塞、根分叉病变等，常伴有各种系统性疾病〔13〕。Hh蛋白是一种分泌蛋白，通过一系列裂解与催化修饰后，C端催化结构域可与胆固醇共价结合，再和软脂酰辅酶A反应，完成Hh蛋白修饰过程，分泌到细胞外〔14〕。Shh在胚胎发育及器官形成中扮演着重要角色，可造成发育畸形，导致肿瘤、纤维化等的发生，同时参与软骨和成骨细胞调节，与血管新生相关，参与多种器官的炎症损伤、组织修复、细胞再生〔15〕。王丽娟等〔16〕研究表明具有抗炎作用的白细胞介素(IL)-10与Shh蛋白增高呈现正相关，由此提示Shh蛋白可通过调节IL-10水平，发挥保护性抗炎作用。Kido等〔17〕研究对种植体周围炎患者和健康者龈沟液中的Shh蛋白及IL-6水平进行比较发现，种植体周围炎患者龈沟液中IL-6与Shh表达高于健康对照组，提示Shh参与种植体周围炎的炎症反应。MMPs家族中MMP-1、MMP-7、MMP-13等多种分子可降解牙槽骨组织中的胶原，进一步造成骨结构破坏〔18〕。MMP-8受机体各种细胞因子的调节，正常情况下，MMP-8与MMP抑制剂(TIMPs)协同生成，处于动态平衡状态。炎症发生时，动态平衡遭到破坏，大量MMP-8生成并激活。MMP-8激活后，不仅直接降解Ⅰ型胶原纤维，还通过激活其他MMPs形成级联效应，增强降解能力〔19〕。与此同时，MMP-8还可作用于患者破骨细胞，加强骨吸收，促进破骨细胞形成。

本研究证明了Shh、MMP-8在慢性牙周炎龈沟液内存在高分泌和高表达。de Araújo等〔20〕研究表明龈沟液中MMP-8和有无慢性牙周炎及其严重程度关系密切。研究证实〔21〕，慢性牙周炎患者龈沟液中Shh是早期诊断及炎症程度判断的良好指标，本研究与其一致。龈沟液中Shh、MMP-8联合可作为反映慢性牙周炎的敏感指标。临床中可通过检测慢性牙周炎患者龈沟液中Shh、MMP-8水平来判断牙槽骨吸收的活跃程度，后续可进一步研究是否能够通过抑制Shh、MMP-8的生成来有效抑制骨吸收，控制慢性牙周炎的进展。

牙周指数常被用来评价牙周状态，随着牙周炎症的发生及炎症程度的增加，牙周指数明显增大。研究表明〔22〕慢性牙周炎患者龈沟液中MMP-8、Shh水平通过有效的牙周治疗后明显降低，与牙周指数的改善具有一定的关系。本研究表明Shh、MMP-8与牙周炎严重程度有很大关联。MMP-8参与牙周组织破坏的病理过程，Shh蛋白对炎症具有保护性作用，随着炎症加重而增高，提示龈沟液中MMP-8、Shh含量与牙周指数之间的关系规律性变化对临床上慢性牙周炎的诊断有一定的指导意义。MMP-8、Shh含量的变化可以作为反映牙周组织破坏和恢复情况的指标，其含量测定有助于牙周炎的诊断。

综上，老年慢性牙周炎患者龈沟液中Shh蛋白、MMP-8呈现高表达，且随着炎症程度的升高呈现增高趋势，二者联合检测可有效反映炎症程度。