不同的呼吸道取样方法在COVID-19核酸检测中的应用

贾丛康 张绍刚

联勤保障部队第九八三医院干三科，天津市 300142

2019年12月，武汉市报道了多例不明原因肺炎病例，随后在全世界多国暴发流行。中国科学院武汉病毒所通过病毒分离、核酸测序，明确了其致病因子是新型冠状病毒[1]。世界卫生组织将此病毒命名为2019新型冠状病毒( 2019 novel coronavirus，2019-nCoV)。 2月11日国际病毒分类委员会冠状病毒研究小组将其正式命名为严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)；对于这种病毒引起的肺炎命名为新型冠状病毒肺炎 (Coronavirus disease 2019，COVID-19)。该流行病潜伏期长，传染性强，临床症状多样，发病机制不明确，目前尚无特效治疗措施，因此及早发现SARS-CoV-2感染者和携带者并进行有效的隔离与治疗，是目前防止疾病播散最有效的方法。随着SARS-CoV-2基因组序列的公布，多项核酸和抗体检测试剂盒被设计开发并投入使用，其中比较成熟、易于实施的核酸检测是确诊SARS-CoV-2感染的重要依据，高危人群的核酸检测也成为防控的有效措施。在流行病学调查及临床诊治新冠肺炎的实践中，常出现呼吸道取样核酸检测假阴性的现象，严重的干扰我们的防控措施。不同部位的标本可能会影响检测阳性率的偏差。因此不同的取样方法获取标本影响检测结果，故本文对上呼吸道采样(鼻咽、口咽、舌及漱口液)和下呼吸道采样(痰、气管及支气管肺泡)的不同方法进行综述。

1 上呼吸道采样

1.1 鼻咽及口咽取样 咽部分区包括鼻咽、口咽及喉咽，三者的黏膜是连续的，均属于上呼吸道的区域(见图1)，经口取样是口咽拭子(OPS)也被称为“咽喉拭子”。它是指对四个口咽腔(扁桃体、软腭、舌根和咽后壁)中的一个或多个进行取样(见图2)。口咽位于口腔后面，开始于硬软腭的过渡区。OPS最常见的靶点是咽后壁，因为它是鼻咽的解剖连续体。在目前的COVID-19爆发中， OPS是最常用的呼吸道取样方法。一项早期重要的研究详细描述了武汉COVID-19患者的临床特征，将OPS作为唯一的呼吸取样方法[2]。然而，据报道OPS的阴性预测值较低。Xie等[3]报道19例血清阳性的COVID-19患者，只有9例(47%)OPS是阳性的，提示从多个部位重复取样对提高诊断率非常重要。口咽拭子取样方便，张口就能进行操作，相对简单，受试者痛苦较小，因此临床上比较常用，但取样者暴露的风险更高，操作者往往需要正对患者口腔，采集过程中患者容易出现刺激性干咳，呕吐等症状使采集者暴露在带病毒的气溶胶中。

图1 鼻—口—喉咽部示意图

图2 口咽拭子取样示意图

经鼻取样是鼻咽拭子，鼻咽拭子(NPS)需要将植绒拭子棒深深地插入鼻咽，以实现与鼻咽后壁的直接接触(见图3)。在目前的COVID-19大流行中，已有文献对鼻咽拭子(NPS)与口咽拭子(OPS)的比较。Zou等[2]的一项研究中，对18名COVID-19患者的72个中鼻甲和鼻咽的样本进行了分析。在这些样本中检测到较高的病毒载量，高于同一组患者中检测到72个OPS样本。但这种多点取样耗时，消耗大量紧缺资源，不适合在大流行情况下进行大规模筛查。经实验室检测比较发现，鼻咽拭子的SARS-CoV-2核酸阳性率明显高于口咽拭子[4]。鼻咽拭子相对口咽拭子优点：(1)可以在咽部停留较长时间，以便获得更足量的标本，这也是文献报道其阳性率高于口咽拭子的原因；(2)取样者的暴露风险相对口咽拭子更低，因为取样时我们取样者是可以站在患者侧后方操作，且要求患者下拉口罩仅露出鼻孔，遮住口腔，不需要直视患者口腔，而且基本不出现咽反射，少数患者取样后可能出现喷嚏反射，患者可用手肘或纸巾遮蔽，且因为取样者不在患者正前方，暴露风险相对更低，减轻取样者的心理压力。缺点是相对口咽拭子患者心理恐惧更大，取样者更多的专业培训。

图3 鼻咽拭子取样示意图

无论是采集鼻咽拭子还是口咽拭子，采集的深度和与黏膜接触的时长是关键。如果采集鼻咽拭子没有采到鼻咽腔深处，采集口咽拭子时患者呕吐反应较大导致取样时间不够，这时可能采集到的细胞绝大部分都是不含病毒的细胞，即可能造成“假阴性”。这也可能是目前报道的多次核酸检测阴性患者在复查时又出现核酸阳性的其中一个原因。我国的一项研究中比较了NPA和OPS方法，回顾了SARS、MERS和H1N1呼吸取样文献，得出结论：在所有上呼吸道取样方法中，鼻和口咽联合拭子(NS+OPS)对医务人员的危害最小[5]。上述结果是否可以推断为SARS-CoV-2尚待评估。

1.2 舌拭子、口腔拭子及漱口水取样 用于检测SARS-CoV-2的舌拭子(LS)或口腔拭子(OCS)包括擦拭舌头或口腔的前三分之二。武汉的一项研究[6]发现，91例COVID-19患者OPS阳性率高于LS。Azzi等[7]报道使用OCS和“口服唾液吸管收集”进行病毒检测。25名重症监护室机械通气的COVID-19患者，所有患者的唾液拭子中检测到SARS-CoV-2，具有不同的Ct值(范围18.12～32.23，平均值27.16±3.07)。所有患者鼻咽拭子都是阳性。该文认为口腔唾液收集是一种可靠的病毒检测方法。然而，应该注意的是，这些结果来自体内病毒量较多危重患者。因此，在筛选方案中，口腔唾液拭子或LS的用途可能不可重复。尽管LS或OCS很简单，而且可能引起的不适较少，但由于需要最大限度地现场采样分泌物，以准确诊断感染，因此在当前的形势下不太可能普遍使用。

由于咽拭子采样方法可能引起喷嚏、咳嗽和干呕，因此在获取拭子样本时，医护人员的接触风险是存在的。Saito等[8]报道，使用漱口水作为拭子取样的安全和敏感的替代方法。用10ml生理盐水漱口取样与OPS比较1例COVID-19患者在发病第8天和第9天的情况。值得注意的是，在漱口液样本中发现了更多的病毒基因组，然而这只是1个病例报告。先前有报道称，对于甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒等呼吸道病原体，漱口水比咽拭子更敏感[9]在本次疫情中，没有更多文献报道漱口水对病毒检测的敏感性和特异性。

2 下呼吸道取样

深部痰液和灌洗液等下呼吸道标本是核酸检测的首选，但由于取样困难，目前筛查多使用鼻咽拭子进行检测[10]。痰标本可在自主咳嗽或外界刺激咳嗽时收集。在一项小样本研究中，对10名COVID-19患者进行痰液收集，检测结果均为阳性；该群患者90%的鼻咽拭子标本中检测到SARS-CoV-2 RNA，但有10%的样本(1名患者)为阴性[11]。Pan等[12]也证实了痰标本对SARS-CoV-2病毒检测的优越性，证实痰样本的病毒载量通常高于咽喉拭子。在机械通气患者中，可通过从气管插管中抽吸或气管切开术后直接气管抽吸获得痰标本，检出率更高。中国麻醉学学会公布了对重症COVID-19患者气管插管的建议，插管过程中大剂量接触载有病毒的气溶胶，除非绝对必要，否则应避免，收集气管抽吸物进行病毒检测对医护人员构成重大风险[13]。Huang等[14]道了16例插管COVID-19患者的上呼吸道样本与气管内抽吸物的病毒载量比较，发现后者的病毒RNA值明显高于鼻拭子和口咽拭子等呼吸取样方法，而且能在重症监护病房机械通气患者病毒载量的连续监测中发挥作用。

最早的SARS-CoV-2基因鉴定是通过武汉病毒学研究所的支气管肺泡灌洗(BAL)样本进行的[1]。支气管肺泡灌洗(BAL)是一种下呼吸系统取样，在这种取样中，支气管镜直接插入气管和支气管，行肺泡灌洗，然后收集灌洗液进行检查。中国和欧洲关于使用BAL样本检测SARS-CoV-2病毒的研究已经大量发表[15-16]，证据表明，BAL可降低假阴性率，可以对高度怀疑而OPS阴性的病例中进行病毒检测[17]。在武汉对4 880名疑似COVID-19患者[疑似COVID-19患者的病例定义：(1)典型的呼吸道感染症状，如发热、咳嗽和呼吸困难；(2)与SARS-CoV-2患者密切接触]的研究中，Liu等[18]发现BAL在SARS-CoV-2检测中的阳性率最高，并报告NS和OPS的联合阳性率为38.25%，而收集的痰的阳性率为49.12%。

综合研究表明，下呼吸道标本尤其是BAL，往往比上呼吸道标本对肺炎的诊断率更高，高度怀疑而诊断不明确或咽拭子检测为阴性的患者，为明确诊断应尽可能获得该标本。然而，下呼吸道取样涉及更大的技术难度和暴露风险。BAL作为筛选工具也是不可接受的。因此，尽管目前的文献越来越强调NPS和OPS的局限性和可能的假阴性结果，但上呼吸道取样仍然是最可行方法。

核酸检测在COVID-19的防治工作中非常重要。假阴性的危害是将受感染的患者释放回社区继续进行病毒传播，从公共卫生的角度来看，有SARS-CoV-2感染症状，但核酸检测呈阴性的患者，应该多次接受检测，并要求居家隔离，避免到公共场所。临床医生对COVID-19的诊断必须建立在一个以上的检测基础上，并考虑患者的风险易感性及接触史。目前多国建议用鼻咽和口咽蜂窝状拭子采集样本进行SARS-CoV-2病毒检测[19]虽然这些方法有其局限性，但容易开展快速筛查，作为大多数国家检测、隔离感染者的可实施战略。下呼吸道采样方法缺乏快速筛查的能力。

SARS-CoV-2与存在于呼吸黏膜、心脏、肾脏、内皮和肠组织中的血管紧张素转换酶2(ACE2)受体具有亲和力[20]。因此，许多其他标本取样方法如血液、尿液和粪便标本的采集已被报道，但还有待进一步研究。国内在复工复产的同时，也面临疫情反弹的压力，所以做好高危人群的检测是重要一环，选择合适的取样方法尽可能的提高患者配合度，减少假阴性率，仍任重道远。