森登-4微生物限度检查方法适用性试验

刘杨 刘建明 李甜

摘要：目的，建立蒙药制剂森登一4的微生物限度检验方法。方法：按《中国药典》2015年版四部非无菌产品微生物限度检查法：控制菌检查法进行适用性试验。结果：供试品5种试验菌回收比在0.5～2之间，控制菌均能正常检出。

关键词：森登-4;微生物限度;适用性试验

本文参考相关文献，根据制剂中成分的抑菌作用强度不同，采用了平皿法（稀释法）建立森登-4相应的微生物限度检查方法，经方法适用性试验证实该方法简易有效。

一、实验材料

1.样品名称

森登-4，批号：20180228、20181101、20190412具由新疆维吾尔自治区博尔塔拉蒙古自治州蒙医医院生产。

2.仪器SPX-150生化培养箱（江苏扬州慧科电子有限公司）;GHP-9162电热恒温培养箱（江苏扬州慧科电子有限公司）;BHC-1300 Ⅱ A2生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）DHG-9245A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）PL602-L型电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）;GI54TW全自動高压灭菌锅（致微（厦门）仪器有限公司）;JLQ-S1菌落计数器（无锡县金城仪器厂）;BHW-IV型电热恒温水浴锅（北京市医疗设备厂）;JFC匀浆仪（漯河市金田试验设备研究所）。

3.培养基及稀释液

胰酪大豆胨琼脂培养基（批号1704142）、胰酪大峨胨液体培养基（批号1703082）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号150824）、肠道菌增菌液体培养基（批号170216）、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（批号150818）、麦康凯液体培养基（批号161228）、麦康凯琼脂培养基（批号150907）、pH7.0氯化钠-蛋白胨水（批号20190129）

4.菌种

枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]、以上培养基和菌种均由中国食品药品检定研究院提供工作菌株为第3代。

二、菌液及供试液制备

1.菌液制备

取经35℃培养18-24小时的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌胰酪大豆胨液体培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数不大于10000cfu/ml的菌悬液;取经35℃培养18-24小时的大肠艾希氏菌、铜绿假单胞菌胰酪大豆胨液体培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数不大于100cfu/ml的菌悬液;取经25℃培养2-3天的白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数不大于10000cfu/ml的菌悬液;取经25℃培养5-7天黑曲霉的新鲜培养物加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将抱子洗脱，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数不大于10000cfu/ml的孢子悬液。

2.供试液制备

取样品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，制成1：10的供试液;取1：10的供试液10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至50ml，制成1：50的供试液。

三、需氧菌总数和霉菌及酵母菌总数计数检查方法适用性

供试液分别加入上述5种代表性实验菌株，再加15-20ml规定的琼脂培养基待凝固后，置规定温度培养24-72小时，观察结果，平板计数，测定回收比值。

测定结果显示：该供试品用1：10的供试品按平皿法对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有明显抑制作用，回收比值小于0.5，采用1：50的供试品按平皿法对规定的菌株无明显抑制作用，回收比值在0.5～2之间，该供试品需氧菌总数计数可采用1：50供试液按平皿法测定，霉菌及酵母菌总数计数可采用1：10供试液按平皿法测定。

四、控制菌检查方法适用性

1.适用性试验

大肠艾希氏菌取1：10的供试液10ml，加入大肠埃希菌菌液1ml，加入100ml胰酪大豆胨液体培养基，混匀，置35℃培养18小时，取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42℃培养24小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上35℃培养18小时，麦康凯琼脂培养基应能检出大肠艾希氏菌反应特征。

耐胆盐革兰阴性菌取样品1：10供试液100ml，置25℃培养2小时，取上述培养物10ml，加大肠埃希菌菌液、铜绿假单胞菌菌液各1ml，摇匀，接种至100ml肠道菌增菌液体培养基中，35℃培养24小时后，分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，35℃培养18小时，紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上应能检出耐胆盐革兰阴性菌的反应特征。

2.上述结果表明，本品的控制菌检查方法为：大肠艾希氏菌，取样品1：10供试液10ml接种至胰酪大豆胨液体培养基中，培养基用量100ml;耐胆盐革兰阴性菌，取25℃培养2小时样品1：10供试液10ml，接种至肠道菌增菌液体培养基，培养基用量100ml。

五、结论

按《中国药典》2015年版四部微生物限度检查法、控制菌检查法进行三次独立适用性试验，5种试验菌回收比在0.5～2之间，控制菌均能正常检出。

参考文献：

[1]中国药典通则四部[M].北京：医药卫生出版社.

[2]中华人民共和国卫生部药品标准蒙药分册[M].卫生部药典委员会.

[3]5种蒙药医院制剂微生物限度检查方法建立及探讨[J].食品安全质量检测学报.