黄绿蜜环菌硒多糖抗氧化活性及抑菌活性研究

（青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，青海师范大学生命科学学院，青海西宁 810008）

硒是维持人体和动物正常生长和发育的重要微量元素之一，具有免疫调节、抗癌、抗氧化等多种生物活性[1]。硒的生物学功能取决于其化学形态，作为膳食补充物的有机硒化合物，与无机硒相比，具有吸收利用率高、营养价值高、更健康和安全等优点。大量研究发现，酵母、细菌和真菌等微生物能富集大量硒并将无机硒转化为有机硒[2-4]。一些学者发现，富硒蕈菌中硒的主要赋存形态为硒蛋白、硒核酸和硒多糖[5-6]。从蕈菌富硒培养物中提取得到的硒多糖，经证实具有一定的抗肿瘤、抗氧化等药理作用[7-9]。因此，硒多糖可作为很好的补硒剂并应用于药品或高附加值的食品中。

黄绿蜜环菌（Armillaria luteo-virens）是一种重要的高原特色蕈菌资源，目前还难以实现人工栽培。一些研究者关注黄绿蜜环菌液体培养产生的菌丝体或发酵液中的代谢产物的成分以及生物活性的研究[10-12]，基于硒对液体培养黄绿蜜环菌生长存在一定的作用[13]，探讨黄绿蜜环菌富硒培养后产生的胞外多糖的抗氧化活性和抑菌活性，旨在为寻找生产硒源的适当途径提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

黄绿蜜环菌菌株由青海师范大学微生物实验室提供。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）：广东微生物研究所。

1.1.2 培养基

真菌培养基：PDA培养基配方为去皮马铃薯200g、一水葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL；液体种子培养基配方为马铃薯200 g、一水葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL；发酵培养基配方为蔗糖40 g、牛肉膏1 g、KH2PO41 g、MgSO41 g、蒸馏水 1 000 mL。

细菌培养基：细菌固体培养采用牛肉膏蛋白胨固体培养基，配方为牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂 15 g、蒸馏水 1 000 mL、pH 7.2～7.4（用 1 mol/L NaOH调节pH值）；细菌液体培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，配方为牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸馏水1 000 mL、pH 7.2～7.4（用1 mol/L NaOH调节pH值）。

1.1.3 试剂与仪器设备

一水葡萄糖（分析纯）：烟台市双双化工有限公司；蔗糖（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；蛋白胨（生物试剂）、牛肉膏（生物试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；KH2PO4（分析纯）、NaOH（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；MgSO4（分析纯）：上海广诺化学科技有限公司；NaCl（分析纯）：天津市瑞金特化学品有限公司；蒽酮（分析纯）：上海展云化工有限公司；抗坏血酸（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂。

LS-35HD型立式压力蒸汽灭菌锅：江阴滨江医疗设备有限公司；250B型生化培养箱、V-5100紫外分光光度计：金坛市富华仪器有限公司；CJ-LS型净化工作台：天津市泰斯特仪器有限公司；TD5A台式低速离心机：湖南赫西仪器装备有限公司；SHA-C型水浴恒温振荡器：金坛市天竞实验仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 黄绿蜜环菌菌株富硒培养

将3块4 mm直径的黄绿蜜环菌菌块接种于种子培养基中，250 mL三角瓶中装入100 mL培养液，于25℃培养4 d，所获培养液作为液体菌种。以15%的接种量将液体菌种接种至发酵培养基中，于25℃下培养4 d时加入100 μL的800 mmol/L亚硒酸钠，使发酵培养基硒浓度为0.80 mmol/L，置于25℃条件下继续培养至8 d。

1.2.2 黄绿蜜环菌硒多糖的提取与纯化

发酵产物以4 000 r/min离心10 min，得到菌丝体和发酵液。发酵液经旋转蒸发仪于50℃减压浓缩至原体积的20%左右，加3倍体积95%乙醇，放入4℃冰箱中醇析24 h，得絮状沉淀，95%乙醇洗涤两次，Sevag法（氯仿∶正丁醇4∶1，体积比）脱蛋白后，45℃条件下干燥得胞外硒多糖。

1.2.3 黄绿蜜环菌硒多糖中硒含量和多糖的测定

根据GB5009.93-2017《食品安全国家标准食品中硒的测定》[14]（第一法），依托广东东方纵横检测有限公司对硒多糖中硒含量进行检测；采用蒽酮-硫酸法[15]测定多糖的含量。

1.2.4 清除羟基自由基

吸取2 mL浓度为9 mmol/L FeSO4溶液与2 mL浓度为9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液、2 mL不同浓度的样品溶液（2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mg/mL）及 2 mL的8.8 mmol/L H2O2混合，置于37℃水浴30 min，冷却至25℃室温后在510 nm波长处测定吸光度（用蒸馏水调零）[16]，不同浓度的抗坏血酸溶液作为对照。羟基自由基清除率计算公式为：羟基自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100。

式中：A0为蒸馏水代替样品溶液的吸光度；A1为样品反应后的吸光度；A2为样品溶液和蒸馏水代替H2O2的吸光度。

1.2.5 清除DPPH自由基

吸取2.5 mL DPPH乙醇溶液（40.00 mg/L）与0.5 mL 不同浓度的样品溶液（2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mg/mL）混匀，于37℃的恒温水浴下避光反应30 min，在517 nm波长处测定混合液的吸光度（用无水乙醇调零），以抗坏血酸作为对照[17]。DPPH自由基清除率计算公式为：DPPH自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100。

式中：A0为2.5 mL DPPH和0.5 mL无水乙醇溶液的吸光度；A1为2.5 mL DPPH和0.5 mL样品溶液的吸光度；A2为2.5 mL无水乙醇和0.5 mL样品溶液的吸光度。

1.2.6 清除ABTS+自由基

取0.2 mL 7.40 mmol/L ABTS溶液与0.2 mL 2.60 mmol/L过硫酸钾溶液混匀，在黑暗、25℃室温条件下放置12h后，用无水乙醇稀释40倍～50倍，以734nm波长处测得的吸光度（0.7±0.02）为宜。再取4 mL上述混合液与 1 mL不同浓度样品溶液（2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mg/mL）混合，振摇 10 s，静置 6 min，在734 nm波长处测定混合液的吸光度[18]。ABTS+自由基清除率计算公式为：ABTS+自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100。

式中：A0为4 mL混合液和1 mL无水乙醇的吸光度；A1为4 mL混合液和1 mL样品溶液的吸光度；A2为4 mL无水乙醇和1 mL样品溶液的吸光度。

1.2.7 硒多糖对细菌的抑菌效果

分别将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于37℃培养18 h～24 h，采用血球计数板法检测细菌浓度，制备106cfu/mL细菌悬浮液。

采用滤纸片扩散法（滤纸片直径6 mm）测定浓度为 2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mg/mL 硒多糖或亚硒酸钠对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用。在无菌培养皿中倒入适量牛肉膏蛋白胨固体培养基，待其冷却，加入0.10 mL供试菌液，涂布均匀，制成含菌平板，将无菌的滤纸片放入平板中央，吸取不同浓度的硒多糖或亚硒酸钠溶液10 μL滴在灭菌的滤纸片上，将处理好的平板置于37℃培养24 h后观察滤纸片周围抑菌圈的大小，并测量其直径。0.04%和0.06%链霉素作为阳性对照，阴性对照为无菌水，每个处理重复3次。

1.3 统计分析

试验数据结果均采用平均值±标准差表示，各项测定指标通过SPSS16.0软件进行单因素方差分析（LSD，P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 黄绿蜜环菌硒多糖中硒和多糖的含量

黄绿蜜环菌硒多糖中硒含量为（2.84±0.23）g/kg，多糖含量为（56.27±0.35）%。

2.2 黄绿蜜环菌硒多糖的抗氧化活性

2.2.1 黄绿蜜环菌硒多糖对羟基自由基的清除能力

不同浓度的黄绿蜜环菌硒多糖或抗坏血酸对羟基自由基的清除效果见图1。

浓度为2.50 mg/mL～12.50 mg/mL的抗坏血酸对羟基自由基的清除能力相对较高，达到96.43%～98.84%；黄绿蜜环菌硒多糖对羟基自由基清除能力随着浓度的升高清除率显著地增加（P＜0.05），但在相同浓度下硒多糖的清除率均低于抗坏血酸。

2.2.2 黄绿蜜环菌硒多糖对DPPH自由基的清除能力

图 2 表示浓度为 2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mg/mL黄绿蜜环菌硒多糖或抗坏血酸对DPPH自由基的清除能力。

图2 黄绿蜜环菌硒多糖对DPPH自由基的清除作用Fig.2 DPPH radical activity of selenium-containing exopolysaccharide extracted from A.luteo-virens

抗坏血酸在测试浓度下对DPPH清除率达到96%～97%；而硒多糖清除DPPH自由基的能力随着浓度的升高而显著上升（P＜0.05），其清除DPPH自由基的效果低于抗坏血酸。

2.2.3 黄绿蜜环菌硒多糖对ABTS+自由基的清除能力

不同浓度的黄绿蜜环菌硒多糖和抗坏血酸对ABTS+自由基有较高的清除效果见图3。

图3 黄绿蜜环菌硒多糖对ABTS+自由基的清除作用Fig.3 ABTS+radical activity at different of selenium-containing exopolysaccharide extracted from A.luteo-virens

浓度为2.50 mg/mL～12.50 mg/mL抗坏血酸清除效果较稳定，而硒多糖清除ABTS+自由基的能力随浓度的增加呈现显著地上升趋势（P＜0.05），但硒多糖的清除效果不如抗坏血酸。

2.3 黄绿蜜环菌硒多糖对细菌的抑菌效果

黄绿蜜环菌硒多糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径见表1。

表1 黄绿蜜环菌硒多糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径Table 1 The inhibition zones of selenium-containing polysaccharide extracted from A.luteo-virens against S.aureus and E.coli

由表1结果可知，相同浓度下黄绿蜜环菌硒多糖抑菌效果低于亚硒酸钠。所测试浓度的黄绿蜜环菌硒多糖对金黄色葡萄球菌没有抑菌效果，对大肠杆菌的抑菌效果较明显；且浓度为7.50 mg/mL～10.00 mg/mL硒多糖对大肠杆菌的抑菌效果显著高于2.50 mg/mL～5.00 mg/mL的硒多糖（P＜0.05）。不同浓度的亚硒酸钠对大肠杆菌抑菌效果也存在显著性差异（P＜0.05），但浓度达到10.00 mg/mL～12.50 mg/mL的亚硒酸钠才能抑制金黄色葡萄球菌的生长。

3 讨论与结论

许多蕈菌作为硒的载体，使硒与多糖组分结合形成硒多糖[4-7]，灵芝在亚硒酸钠浓度为 100、200、250 μg/kg的基质上生长，获得3种硒多糖中多糖含量依次为85.9%、86.3%、87.1%，而硒含量分别为 20.53、49.62、60.50 μg/g[7]。本研究中利用黄绿蜜环菌在0.8 mmol/L亚硒酸钠浓度下培养获得的胞外硒多糖中硒的含量为（2.84±0.23）g/kg，多糖含量为（56.27±0.35）%，由此说明富硒培养时菌种不同、加入无机硒的浓度不同，提取出的硒多糖的硒含量也会存在差异，而多糖含量相对恒定。

通过体外抗氧化活性测定，从富硒蕈菌中获得的硒多糖对羟基自由基、DPPH自由基、ABTS+自由基清除能力高于不加硒得到的多糖，说明了硒在抗氧化能力方面起到关键性作用[7-8]，随着硒多糖浓度的增加其抗氧化活性增强，但清除自由基的能力仍不如抗坏血酸[8]。本研究结果也证实黄绿蜜环菌硒多糖抗氧化活性与其浓度密切相关。

蕈菌液体培养产生的多糖物质除了具有抗氧化活性外，还对细菌、真菌等微生物具有抑制作用[19-20]。以猪苓多糖和亚硒酸钠为原料，采用化学合成法制备猪苓硒多糖，猪苓硒多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母和黑曲霉的抑制效果强于猪苓多糖[21]。可见，硒能提高多糖的抑菌能力。本试验发现黄绿蜜环菌硒多糖对大肠杆菌的抑菌效果明显，而对金黄色葡萄球菌没有抑菌效果（表1）。黄绿蜜环菌富硒培养后获得的胞外硒多糖，体外测试具有一定的清除自由基能力和抑制细菌生长的活性，而有关黄绿蜜环菌硒多糖动物试验功能特性的表现以及应用于食品中发挥的功能作用还有待进一步的研究。