响应面优化火麻油及有氧运动对骨质疏松大鼠骨密度的影响

（郑州工业应用技术学院，河南郑州451199）

火麻，别称山丝苗、线麻、胡麻、汉麻等。桑科，大麻属一年生直立草本，在我国种植火麻的主要地方包括广西、云南、甘肃等省份[1]。火麻油的营养成分，其中不饱和脂肪酸含量丰富，大约有89%左右，不饱和脂肪酸主要为油酸占9.6%～14.7%、亚油酸占52.2%～58.2%和亚麻酸占15.2%～23.9%[2-3]。火麻油中还含有氨基酸、维生素E、矿物质元素、不溶性纤维、甾体类、生物碱类、黄酮类和苷类等成分，所以营养价值非常丰富[4-5]。尤其火麻油含有丰富的矿物质元素，K、Mg、Ca、Na、Fe、Mn、Cu、Zn 等人体必需的矿物质，其中元素 K、Mg、Ca的含量特别高[6]。K是细胞内液的主要离子，Mg对机体心脏的调节起到重要作用，Ca是骨骼、牙齿及软组织的重要成分，缺钙易得佝偻病、骨质疏松症、心血管病等[7]。

骨质疏松症是一种以全身骨量减少、骨密度损失及骨组织微观结构退化为特征，骨折危险性增大的全身代谢性疾病[8]。临床以周身疼痛、身高降低、驼背、脆性骨折及呼吸系统受影响等为主要表现[9]。因此，改善骨质疏松主要就是减少骨量丢失，增加骨质形成，补充骨矿物质，提高骨密度。诸多研究表明，运动锻炼有利于骨质健康，增加骨代谢，使骨形成较好的结构和强度。一旦运动不足会导致骨密度低下，增加患骨质疏松症的风险[10-11]。

当前，对于火麻油的提取主要有肇立春等[12]利用冷榨法来提取火麻油，彭丹[13]等利用微波辅助来提取火麻油，曾凡炎等[14]利用超声波与微波辅助来提取火麻油，以上几种方法在提取火麻油中较为普遍。本文利用响应面优化溶剂法提取火麻油，以便为今后的工业生产提供更多的技术支持。由于火麻油的微量元素含量较为丰富，并且根据其Ca含量较高的特点，而且Ca是骨骼中重要组成部分，设计一个大鼠骨质疏松的模型，通过雌性大鼠摘除卵巢，使体内雌激素分泌减少，雌激素在机体内由于参与骨代谢，从而造成骨吸收增强，致使快速的骨丢失，考察火麻油对大鼠骨密度的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

火麻仁：长春市方一堂经贸有限公司；石油醚：天津科密欧试剂有限公司；大鼠骨钙素（OC）、磷（P）、雌二醇试剂盒：南京建成生物工程研究所；SPF级雌性SD大鼠50只 [体重在（150±5）g[SYXK（苏）2018-0008）]：江苏集萃药康生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

KJ3000+骨密度仪：南京科进实业有限公司；RE-201D型旋转蒸发仪：郑州科文仪器设备有限公司；HZY-1202型天子天平：上海茂宏电子科技有限公司；DFT-100A型粉碎机：无锡久平仪器有限公司；BK-200型生化分析仪：山东博科生物产业有限公司；ZH-PT型动物实验跑台：安徽正华生物仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 火麻油的制备

选取火麻仁适量，将其粉碎至粒度为可以过100目筛。将之前处理好的火麻仁粉末称取适量，放入圆底烧瓶中，加入一定量的石油醚，调节到设置的温度、提取时间，进行提取，提取完成后，蒸发掉溶剂，干燥称重，得到火麻油[13，15]。

式中：Y为火麻油得率，%；m火麻油质量，g；n火麻仁粉末质量，g。

1.3.2 单因素试验

在提取温度40℃、提取时间90 min，设定不同液料比为 6 ∶1、10 ∶1、14 ∶1、18 ∶1、22 ∶1（mL/g）；在液料比为 14 ∶1（mL/g）、提取时间 90 min，设定不同提取温度分别为 30、35、40、45、50 ℃；在液料比为 14 ∶1（mL/g）、提取温度40℃，设定不同提取时间分别为30、60、90、120、150 min，考察火麻油得率的影响。

1.3.3 响应面法优化火麻油提取工艺

在单因素试验的基础上，通过火麻油得率（Y）为指标，液料比（X1）、提取温度（X2）和提取时间（X3）为因素，进行三因素三水平响应面试验设计，采用Design-Expert 8.0软件设计的Box-Behnken试验，试验因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平Table 1 Box-Behnken test design factor level

1.3.4 动物模型、分组以及运动方案

模型设计：大鼠使用35 mg/kg戊巴比妥钠经腹腔麻醉后，剃掉其毛发，在大鼠的脊柱两侧切开背肌大约1.5 cm切口，摘除卵巢。使用可以吸收的羊肠线缝合大鼠伤口，术后腹腔注射60×104U/kg青霉素钠，1次/d，持续注射5 d，以防术后感染。大鼠全部存活并没有出现感染症状[16]。

选取SPF级雌性SD大鼠50只，体重在（150±5）g，随机分成5组，每个小组10只大鼠，分成对照组、模型组、运动组、火麻油组、火麻油运动组。其中对照组不进行手术，其余组以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，摘除双侧卵巢。除了对照组、模型组、火麻油组，其余2组SD大鼠放置在动物跑台上进行跑步训练，第一周对大鼠进行跑步适应训练，将跑台参数设置成0度、10 m/min、45 min，使大鼠跑步训练保持45 min；第二周开始将跑台参数设置成7度、25 m/min，直至大鼠力竭。大鼠力竭的标准为，使用毛刷刺激大鼠尾部，大鼠在跑步过程中与跑台预设速度出现不一致情况，其臀部压在跑台上，而且后肢与跑台皮带后拖达到20 s以上。火麻油组对其进行灌胃0.8 mg/g的火麻油；火麻油运动组在按照运动组进行跑步运动之外，每天对大鼠灌胃0.8 mg/g的火麻油，并观察每天大鼠的变化，实验持续6周[17-18]。

1.3.5 相关指标检测

大鼠骨钙素（OC）、磷（P）、雌二醇含量测定：各组大鼠麻醉后腹主动脉取血，分离血清，-25℃保存，根据酶学试剂盒的说明书检测分析；骨密度测定：采用骨密度仪对大鼠腰椎骨进行检查。

1.4 统计学分析

本文使用SPSS 18.0软件进行数据分析，数据均使用均值±标准差来表示，采取组间进行对比，P＜0.05、P＜0.01表示具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比对火麻油得率的影响

液料比对火麻油得率的影响见图1。

图1 液料比对火麻油得率的影响Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on the yield of hemp oil

由图1分析，液料比的增加，使得火麻油的得率逐渐升高，在14∶1（mL/g）时得率达到最高，继续增加液料比提取趋于不变。这是因为液料比的增加，使得火麻仁与提取溶剂之间接触更加充分，提取逐渐提高。继续增加液料比，火麻油得率反而趋于平衡，考虑到溶剂回收时间和成本的问题，因此液料比选择14 ∶1（mL/g）。

2.1.2 提取温度对火麻油得率的影响

提取温度对火麻油得率的影响见图2。

由图2分析，提取温度的增加，使得火麻油的得率逐渐升高，当温度达到45℃时得率达到最高，继续升高温度，火麻油得率出现降低。因为温度过高会导致火麻油中其他活性成分在溶剂中的浓度随之提高，从而与火麻油形成竞争，导致得率降低，另外温度过高会导致火麻油营养成分被破坏，降低了原有的生物活性。

图2 提取温度对火麻油得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of hemp oil

2.1.3 提取时间对火麻油得率的影响

提取时间对火麻油得率的影响见图3。

图3 提取时间对火麻油得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the yield of hemp oil

由图3分析，提取时间为90 min时，火麻油得率达到最高，时间继续延长得率反而有所降低。这是由于90 min时，火麻油提取接近完全，从得率和节省时间等方面来分析，再继续延长提取时间得率反而稍有降低，因此，选择提取时间为90 min。

2.2 响应面法试验结果与分析

在单因素试验的基础上，确定各因素最佳水平值范围，采用响应面法试验设计，以火麻油得率（Y）为指标，液料比（X1）、提取温度（X2）和提取时间（X3）为因素，进行三因素三水平响应面试验，设计Box-Benhnken试验中心组合试验。响应面分析方案与结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Box-Behnken test design and results

续表2 Box-Behnken试验设计与结果Continue table 2 Box-Behnken test design and results

响应面回归模型ANOVA分析结果见表3。

表3 响应面回归模型ANOVA分析结果Table 3 Response surface regression model ANOVA analysis results

响应面分析方案与结果如表2，采用Design-Expert 8.0软件对表3试验数据进行多元回归拟合，得到多元回归方程：

Y=-82.18+3.37X1+1.44X2+1.91X3-0.70X1X2+0.26X1X3-0.25X2X3-3.88X12-3.99X22-2.14X32

由表3的ANVOA分析可知：模型P=0.000 1＜0.01极显著，失拟项P=0.505 5＞0.05不显著，说明方程对该试验具有较好的拟合性，试验误差较小。相关系数R2=0.999 3，调整系数Adj.R2=0.998 3也表明上述模型拟合程度较好。该模型可用于提取火麻油。

对火麻油得率影响顺序依次为：液料比（X1）＞提取时间（X3）＞ 提取温度（X2）。并且液料比（X1）、提取温度（X2）和提取时间（X3）影响都达到了极显著水平（P＜0.01）；X1X2达到极显著水平（P＜0.01）、X1X3达到显著水平（P＜0.05）、X2X3达到显著水平（P＜0.05）；液料比（X1）、提取温度（X2）和提取时间（X3）各因素的二次项对得率影响极显著（P＜0.01）。

2.3 响应面法分析最佳工艺方案

液料比与提取温度对得率的影响见图4。

图4 液料比与提取温度对得率的响应面分析Fig.4 Response surface analysis of the ratio of liquid to material and extraction temperature to the yield

液料比与提取时间对得率的影响见图5。

图5 液料比与提取时间对得率的响应面分析Fig.5 Response surface analysis of liquid-to-material ratio and extraction time to yield

提取温度与提取时间对得率的影响见图6。

图6 提取温度与提取时间对得率的响应面分析Fig.6 Response surface analysis of extraction temperature and time to yield

通过上述分析得火麻油最佳提取条件为：当液料比为16∶1（mL/g）、提取温度为46℃、提取时间为104 min时，火麻油的得率为83.45%。选取上述组合做3次验证试验，得出火麻油的平均得率为83.39%。与预测值相近，证明该工艺可以用来提取火麻油。

2.4 火麻油结合运动对骨质疏松大鼠骨密度的影响

火麻油结合运动对骨质疏松大鼠骨密度的影响见表4。

表4 火麻油结合运动对骨质疏松大鼠骨密度的影响Table 4 Effects of hemp oil combined with exercise on bone mineral density in osteoporotic rats

从表4得出，模型组大鼠骨钙素（OC）与对照组相比明显提高（P＜0.05），运动组、火麻油组、火麻油运动组大鼠骨钙素（OC）与模型组相比明显降低（P＜0.05），火麻油运动组大鼠骨钙素（OC）与对照组相比不具有显著性差异（P＞0.05）；模型组大鼠磷（P）与对照组相比明显降低（P＜0.05），火麻油运动组磷（P）与模型组相比明显提高（P＜0.05），火麻油运动组磷（P）与对照组相比不具有显著性差异（P＞0.05）；模型组大鼠雌二醇与对照组相比明显降低（P＜0.05），运动组、火麻油组、火麻油运动组雌二醇与模型组相比明显提高（P＜0.05），火麻油运动组雌二醇与对照组相比不具有显著性差异（P＞0.05）；模型组大鼠骨密度与对照组相比明显降低（P＜0.05），火麻油运动组骨密度与模型组相比明显提高（P＜0.05），火麻油运动组骨密度与对照组相比不具有显著性差异（P＞0.05）。

研究表明女性在绝经之后骨质疏松症状逐年提高[19]，骨质疏松是一种多原因引发骨量丢失，骨结构退化的疾病[20]。运动是当前治疗骨质疏松的重要方法，相对来说跑步、走路等运动对于骨密度的增加使其产生的效果需要在10～12个月左右，所以通过食物或者药物来配合可以达到更好的效果[21]。本文中大鼠通过切除双侧卵巢后，导致自身代谢出现紊乱，出现骨质疏松症状，血清中OC水平可以作为评价骨转换率以及骨形成的重要指标，磷（P）的水平是评价骨质疏松症状效果的重要指标，代表了骨组织中无机物的变化状态，通过以上指标可以反映骨代谢情况，而且会参与到成骨细胞分化及基质的矿化的整个过程[22]，模型组的血清OC明显高于其他组，模型组的磷（P）水平明显低于其他组，表明模型组的骨转化率高于其他组，骨质疏松症状明显，说明经过有氧运动干预以及灌胃火麻油可以调节骨代谢平衡，降低骨转换率，起到抑制骨质疏松的作用；雌二醇可以对成骨细胞和破骨细胞的调节来反映机体的骨钙代谢，模型组的雌二醇低于其他组，说明经过有氧运动干预以及灌胃火麻油可以调节骨钙代谢之间的平衡，减弱成骨细胞的骨形成能力；骨密度是骨骼强度的一个重要指标，大鼠通过切除双侧卵巢6周后，模型组的骨密度明显低于其他组，说明经过有氧运动干预以及灌胃火麻油可以抑制破骨细胞分化、阻碍骨吸收，进而改善骨密度，接近正常大鼠的骨密度。并且火麻油结合有氧运动要比运动组和火麻油组单一效果要好。

3 结论

通过溶剂法提取火麻油的最优工艺条件为：当液料比为16∶1（mL/g）、提取温度为46℃、提取时间为104 min时，火麻油的得率为83.45%。选取该组合做3次验证试验，得出火麻油的平均得率为83.39%。与预测值相近，证明该方法的可行性。同时大鼠实验表明，火麻油结合有氧运动对骨质疏松模型大鼠的骨钙素（OC）、磷（P）水平、雌二醇水平、骨密度 4项指标起到积极作用。说明经过有氧运动干预以及灌胃火麻油可以调节骨代谢平衡，降低骨转换率，减弱成骨细胞的骨形成能力，抑制破骨细胞分化、阻碍骨吸收，进而改善骨密度，起到抑制骨质疏松的作用。并且火麻油结合有氧运动的效果要优于两者单独作用，为今后的相关研究提供了宝贵经验。