酸度调节剂协同水分保持剂对牛肉盐溶蛋白凝胶保水性的影响

滕安国，李冰馨，赵静怡，李雪涛，张芹

（天津科技大学食品科学与工程学院，天津300457）

肉的保水性（water-holding capacity，WHC）是评价肉制品品质的重要指标之一，直接影响着肉的滋味、香气、多汁性、营养成分、嫩度以及颜色等食用品质[1]。盐溶蛋白是影响肉制品品质特性的主要肌肉蛋白质，盐溶蛋白拥有特殊的化学结构，电荷之间的相互作用力可使蛋白质结构松散，热诱导凝胶形成稳定的三维结构，从而提高肉制品的品质，增加保水效果[2]。

磷酸盐作为水分保持剂[3]，在熟肉制品和预制肉制品加工时，常用磷酸盐有焦磷酸钠（sodium pyrophosphate，SPP）、三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate，STP）和六偏磷酸钠（sodium hexametaphosphate，SHP）[4-7]，磷酸盐也有一定的酸度调节剂作用[8]。磷酸盐能改变肌原纤维蛋白的热诱导凝胶流变特性[9]，提高盐溶蛋白质凝胶保持水分和脂肪的能力，减少营养成分的损失，从而影响肉制品保水性、成品率[10]。但是，长期食用过多含磷酸盐类食品，会降低人体对钙的吸收，导致机体钙磷失衡[11]，甚至会导致某些家族遗传性疾病及慢性肾病患者发生血管钙化[12]。近年来，无磷保水剂成为研究热点。张杰等[13]研究柠檬酸三钠等无磷保水剂对牦牛肉糜保水性发现，添加1.20%柠檬酸三钠时蒸煮损失和离心损失最小。柠檬酸钠（sodium citrate，SC）作为无磷保水剂作用在海产品上，得出最优组合为氯化钠0.5%、SC 1.8%、海藻糖0.5%，蒸煮损失率从50.06%降至39.11%，WHC从3.70%提高至6.03%[14]。SC作为食品、饮料工业中的调味剂、乳化剂、膨胀剂、稳定剂等被广泛应用[15-16]。在肉制品加工上，柠檬酸盐作为酸度调节剂可适量使用[8]。

然而，在食品工业上，完全替代磷酸盐的保水作用，尚有一定难度。本研究从水分保持剂的实际应用角度出发，并综合考虑消费者对食品健康的需求，以柠檬酸盐逐步替代磷酸盐为目的。本研究在SPP、STP和SHP 3种水分保持剂的基础上，加入酸度调节剂SC，研究复合盐对牛肉凝胶的保水性，并将盐溶蛋白液进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），分析凝胶保水性与盐溶蛋白质之间的关系。柠檬酸盐协同磷酸盐保水作用的研究有着现实意义，不仅能够减少磷酸盐的过量添加，而且能提高肉的离子强度、提高pH值[17]、螯合金属离子[18]，从而改善肉品品质。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛背长肌：市售冷鲜肉；SPP、STP、SHP、SC 均为食品级：天津大学科威公司。

TQ-5型绞肉机：广东恒联食品机械有限公司；XHF-D型高速组织匀浆机：宁波新芝生物科技股份有限公司；G10型离心机：白洋离心机厂；PB-21型酸度计、BSA224S-CW型分析天平：德国Sartorius公司；XMTD-204型恒温水浴锅：天津市欧诺仪器仪表有限公司；DFG80-1型电热鼓风干燥箱：湖北黄石市医疗器械厂；JY-SCZ2型电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司；ChemiDocXRS型凝胶成像仪：Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 盐溶蛋白的制备

牛肉剔除结缔组织置于绞肉机中打成肉糜，称取20 g肉糜，加入0.6 mol/L NaCl溶液80 mL，用高速组织匀浆机进行匀浆处理（4℃，8 000 r/min，30 min），匀浆液在4℃条件下静止放置24 h；双层纱布过滤，粗滤液经4 000 r/min离心5 min后，所得上清液即为盐溶蛋白溶液[19-20]。

1.2.2 盐溶蛋白凝胶的制备及试验设计

取盐溶蛋白溶液称重，分别按质量分数加入SPP、STP、SHP和SC，溶于离心管中充分混匀后加热，从30℃缓慢升温到70℃，升温速率为1℃/min，70℃恒温保持5 min，形成的凝胶用自来水冷却至25℃。

1.2.2.1 单因素试验设计

在制备蛋白凝胶后添加4组盐，分别为SPP、STP、SHP和SC，每组按质量分数0.05%、0.1%、0.15%、0.2%和0.25%梯度添加，每个梯度重复3次，进行盐溶蛋白pH值测定和凝胶保水性测定。

1.2.2.2 正交试验设计

SPP、STP、SHP和SC组成复合盐，试验共4个因素，以单因素试验得到每种盐最适添加量为基础，设3个水平，通过L9（34）正交试验表设计9组试验（n=3），通过试验结果、R和极值，进行正交试验综合分析，得出最优组合。

1.2.3 凝胶保水性的测定

将制备的盐溶蛋白凝胶3 000 r/min离心5 min后称量，将已离心样品中的水分用滤纸吸干，再称重。每个处理测定3个重复，4℃条件下保存待测。牛肉凝胶保水性按照公式（1）计算。

式中：m、m1、m2分别为离心管质量、离心管和离心后凝胶质量、离心管和离心前凝胶质量，单位均为g。

1.2.4 盐溶蛋白凝胶的SDS-PAGE分析

将提取的盐溶蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳，试验所采用的浓缩胶和分离胶的浓度分别为3%和10%。将盐溶蛋白质溶液浓度稀释到1 mg/mL，上样量为 10 μL[21]。

1.3 数据分析

数据处理采用SPSS 16.0软件统计分析数据，使用CompareMeans下One-WayANOVA进行标准差分析和显著性检验。试验结果以平均值±标准差表示，每组n=3。

2 结果与分析

2.1 单一盐的保水性

按照食品添加剂使用GB2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》的用量规定，复合磷酸盐使用时以磷酸盐计，不得超过5 g/kg。不同磷酸盐及柠檬酸盐添加量对盐溶蛋白溶液pH值的影响见图1，单一盐的不同添加量对盐溶蛋白凝胶保水性的影响见图2。

图1 磷酸盐及柠檬酸盐对盐溶蛋白溶液pH值的影响Fig.1 Effect of phosphate on pH value of salt soluble protein solution

肌球蛋白的等电点在5.0左右，从图1可以看出，加入磷酸盐和柠檬酸盐均可以使盐溶蛋白的pH值升高，且表现为浓度依赖性，但在盐浓度达到0.25%时，添加STP、SHP和SC的盐溶蛋白的pH值均有所降低。盐溶蛋白的pH值升高，偏离肌球蛋白等电点，使得凝胶过程中蛋白质的交联作用增强，形成致密的网状结构。通过试验前期测得（见表1），1%的SPP水溶液pH值为10.0～10.2；1%的STP水溶液pH值为9.3左右，均为碱性，可以提高盐溶蛋白凝胶的保水性，并随着加热pH值不发生显著性变化（P＞0.05）。

图2 磷酸盐及柠檬酸盐对盐溶蛋白凝胶保水性的影响Fig.2 Effect of phosphate on water holding capacity of salt soluble protein gel

从图2可知，在牛肉中添加磷酸盐可增加盐溶蛋白凝胶的保水性。SPP在添加量为0.2%时达到最大值，而后由于凝胶均一性变差[22]，导致WHC下降；随着STP添加量的增加，WHC逐渐增加，最适添加量为0.15%；SHP的添加量在0.1%之后随着百分比的增加WHC小幅度的增加，最适添加量为0.15%。

表1 不同加热温度条件下1%磷酸盐溶液pH值Table 1 pH value of 1%phosphate solution at different heating temperature

SC是目前最重要的柠檬酸盐，其安全无毒，作为食品添加剂广泛使用[23]。SC属于弱酸强碱盐，其水溶液显碱性，具有良好的pH值缓冲性能。SC可以提高肉的pH值，因而能够阻止因pH值降低而引起的肉保水性问题。

由图2可知，随着SC添加量的增加，盐溶蛋白凝胶保水性提高，图1表明SC可以提高pH值，故可使肌球蛋白pH值偏离等电点，从而使凝胶保水性增强。Kuwahara等[24]的研究结果与本研究相似，SC可以抑制鱿鱼肌肉蛋白质的自溶活性，从而改进鱿鱼的蛋白凝胶性能。同时，SC在结构上与多聚磷酸盐类似，具有多个离子结合点，能够增加肉中各种蛋白的电荷，使其蛋白间相斥，产生更多容纳水的空间。SC作为品质改良剂对鱿鱼外套膜肌肉蛋白凝胶的强度、保水性存在着显著性关系[25]。因此，SC可作为一种理想的保水剂。

2.2 柠檬酸盐与磷酸盐最佳配比的测定

在单因素试验的基础上，选择 SPP（A）、STP（B）、SHP（C）和SC（D）的最适添加量为因素进行正交试验。结果见表2。

表2 柠檬酸盐与磷酸盐的正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test for citrate and phosphate

续表2 柠檬酸盐与磷酸盐的正交试验因素水平表Continue table 2 Factors and levels of orthogonal test for citrate and phosphate

由表2可知，第1号试验的pH值为5.69最大，但是与第6、9号试验结果5.68差别不大，通过极值分析得出pH值较优组合为A2B3C3D1。从表2可以看出，第6号试验的WHC为93.98%，试验结果较好，其因素组合为A2B3C2D1。根据R值，影响牛肉盐溶蛋白凝胶保水性的主次因素为：A＞B＞C＞D，即SPP对凝胶保水性影响最大，其次是STP、SHP，SC对凝胶保水性影响相对较小。从极值分析得出WHC较优组合为A2B3C3D1，即SPP、STP、SHP和SC 的质量配比为 2∶2∶2∶3，与较好组合不一致。由于较优组合不在正交试验的9次试验中，因此需要进一步验证试验。李跃文[26]使用复合磷酸盐改良鸭肉加工品质，SPP∶STP∶SHP最佳配方为5∶4∶4，与本研究所得配方中接近，SC和SPP水溶液都呈碱性，添加SC可以使SPP用量降低。

2.3 最佳配比验证试验

通过pH值和WHC的极值分析，同时得到较优组合为 SPP∶STP∶SHP∶SC 的质量配比为 2∶2∶2∶3，可见pH值与WHC有较强的关联，因此，下文研究只考虑WHC。按比例称取4种盐充分混匀成复合盐，在此条件下进行验证试验（n=3），添加0.5%复合盐到盐溶蛋白溶液中，制备凝胶。通过试验WHC为（94.03±0.32）%，均高于正交试验的9组结果，表明该较优组合为最佳配比。

2.4 复合盐最佳添加量的确定

根据GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》的用量规定，本文对添加量大于0.5%的情况不做研究。复合盐添加量对牛肉凝胶保水性的影响见表3。

由表3可以看出，随着复合盐添加量的增加，盐溶蛋白凝胶保水性显著性增加（P＜0.05），当添加量达到0.4%～0.5%时，WHC值趋于稳定，而低于0.2%，凝胶的保水性相对较低。

表3 复合盐对盐溶蛋白凝胶保水性的影响Table 3 The effect of compound salt on water holding capacity of salt soluble protein gel

2.5 盐溶蛋白凝胶的SDS-PAGE分析

为了研究凝胶保水性与形成凝胶的盐溶蛋白质之间的关系，选取一组空白、单因素试验中4种盐最佳添加量，以及4种盐的最佳配比复合盐，共6组样品，添加到牛肉盐溶蛋白溶液中，进行SDS-PAGE分析，结果见图3。

图3 添加不同盐类盐溶蛋白凝胶SDS-PAGE图Fig.3 SDS-PAGE map of salt soluble protein gel

分子量在220 kDa处的是肌球蛋白重链[27]，通过SDS-PAGE图看出，CP组的肌球蛋白链比其他组条带浓度稍大，STP组在此处条带浓度较低，说明经过不同条件处理的盐溶蛋白溶液的蛋白质组分有一定差异。由图3可知，在97.4 kDa～31 kDa之间，各组的蛋白条带位置相似，说明蛋白种类无显著差别。但各组电泳条带的浓度有一定差异，说明将复合盐添加到牛肉盐溶蛋白中，会部分改变蛋白质的分子结构，影响蛋白质的含量，进而影响保水性能。王嵬等[28]研究表明用4%草鱼内脏水解蛋白液和0.2%复合磷酸盐溶液，南美白对虾解冻损失和蒸煮损失都较单独磷酸盐组降低，说明蛋白质含量的改变能有效促进产品保水性，与本研究结果相似。

3 结论

降低磷酸盐的使用是当前研究热点，通过本研究发现，各种磷酸盐与柠檬酸盐对牛肉盐溶蛋白凝胶的保水性均有一定的影响，利用各单盐之间的协同增效作用，将SPP、STP、SHP与SC复合，且当四者添加量为2∶2∶2∶3（质量比），复合盐的添加量为0.5%时，凝胶保水率可达94.03%。同时研究发现pH值对保水率有一定程度的影响，SC的碱性可以促进牛肉肌球蛋白偏离等电点，从而增加保水性。通过对不同盐溶蛋白进行SDS-PAGE电泳分析可知，复合盐能改变蛋白质的分子结构，影响蛋白质的含量，从而影响肉的保水性。