CRP 基因rs1205 位点单核苷酸多态性与支原体肺炎发病风险及严重程度相关性

陈 捷 张 立

肺炎支原体是一种附着于纤毛上皮细胞并在呼吸道黏膜中破坏它们的微生物，可引发各种严重程度的疾病，从轻度上呼吸道感染到严重的非典型肺炎[1]。在肺炎支原体感染的免疫应答过程中，遗传多态性的作用不容忽视，特定基因可能影响肺炎支原体的易感性[2-3]。遗传多态性与肺炎支原体感染之间的关系越来越受到公众的关注。CRP 是机体在急性感染时由炎症刺激所产生的一种能够加强机体吞噬作用的蛋白，CRP 蛋白水平与感染引起炎症反应强度有关[4-5]。rs1205 位点是位于CRP 基因3'非翻译区（UTR）的一个单核苷酸多态性（SNP）位点，该位点突变与CRP 的表达水平有关[6-8]。本研究通过病例对照研究的方式分析CRP 基因rs1205 位点SNP 与儿童支原体肺炎感染风险及其严重程度的相关性，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择2015 年2 月—2018 年12 月杭州市儿童医院收治的205 例支原体肺炎患儿作为研究组，根据病情严重程度[9]分为轻症组107 例、重症组98 例。另招募205 例急性病毒性上呼吸道感染患儿作为对照组。所有患儿监护人均签署知情同意书，本研究经过我院医学伦理委员会审核批准，批件号：（2015）年伦审（临研）第（12）号。

1.2 诊断标准 儿童支原体肺炎的诊断标准[10-11]：（1）主要表现为持续剧烈的咳嗽。（2）胸片或肺部CT呈肺间质浸润性、小叶性、大叶性肺实变。（3）肺炎支原体抗体血清学检测：急性期和恢复期双份血清特异性IgG 抗体比较呈4 倍以上的升高或下降到原来的1/4；或单份血清特异性IgM 抗体阳性。（4）肺炎支原体核酸检测：鼻咽分泌物或痰液核酸检测阳性。急性病毒性上呼吸道感染的诊断标准[9-10]：（1）有鼻塞、流涕、咽部不适、干咳、发热等临床表现，查体：咽部红肿，双侧扁桃体未见分泌物。（2）外周血白细胞计数正常或者偏低。（3）胸片检查正常。

1.3 纳入及排除标准 纳入标准：（1）年龄1～13 岁；（2）临床资料完整。排除标准：（1）合并有其他脏器疾病；（2）患有炎症性疾病；（3）由肺炎支原体以外的其他病原体感染引起的肺炎。

1.4 CRP 基因rs1205 位点基因型分析 所有受试者均取5mL 肘静脉血，3000r/min 离心20min 后分离上清血浆，保存于-80℃冰箱，用于血浆CRP 蛋白检测。取分离血浆后的白细胞层，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen，51106，German）提取基因组DNA，以提取的基因组DNA 为模板，CRP 基因rs1205 位点PCR 扩增引物为，5'-CTTGGCTCCTCCACTTCCAG-3'（正向）；5'-TGAACCTGGGACCACCAGTA-3'（反向）。进行PCR 扩增，PCR 反应体系为无菌双蒸水13.8μL；2μL 10×PCR buffer；1μL 10mM dNTP mix；1μL Primer Forward；1μL Primer Reverse；0.25μL Taq DNA Polymerase；1μL 基 因 组DNA，PCR 反应程序为95℃，5min；（94℃，45s；58℃，45s；72℃，30s）30cycles；72℃，10min。PCR 产物采用DNA Gel Extraction Kit（D0056，Beytime）纯化，然后采用Sanger 测序分析SNPs 位点序列信息，确定基因型，见图1。

1.5 酶联免疫吸附法（ELISA）检测血浆CRP 蛋白水平 使用购自美国R&D Systems 公司的human CReactive protein quantikine ELISA kit（catlog：DCRP00，批号R0201503125、R201503127）检测受试者血浆CRP 蛋白水平，敏感度为0.022ng/mL，检测限为0.8～50ng/mL，每个样品检测时均设置3 个复孔。

图1 CRP 基因rs1205 位点不同基因型Sanger 测序结果

1.6 统计学方法 应用SPSS 20.0 软件分析本研究数据，连续参数和非参数数据以均数±标准差（）表示，分类变量用[n（%）]表示，Pearson 卡方检验用于比较分类变量，通过ANOVA 比较正态分布的连续变量的平均值，Mann Withney U 检验比较偏态分布连续变量，两组间非参数统计学分析采用t 检验，基因型频率采用χ2检验是否符合Hardy-Weinberg 平衡，采用优势比（OR）和95%置信区间（CI）分析CRP基因rs1205 位点各基因型发生支原体肺炎的风险，并采用多因素Logistic 回归分析对年龄、性别等因素进行校正，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组患儿一般资料比较 轻症组男65 例，女42 例，年龄2～13（6.25±2.14）岁，病程1～6（4.17±1.24）天；重症组男50 例，女48 例，1～12（6.31±2.32）岁，病程1～6（4.19±1.31）天。对照组男112 例，女93例，年龄2～14（6.51±2.53）岁，病程1～5（4.09±1.17）天。三组年龄、性别、病程等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，轻症组和重症组病程比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 CRP 基因rs1205 位点SNP 与支原体肺炎发病风险的相关性 经遗传学平衡检测，本研究所选受试者群体CRP 基因rs1205 位点基因型频率符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。以CC 基因型为参考，研究组患者CT 基因型和TT 基因型频率均显著低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。CRP 基因rs1205 位点加性模型、显性模型和隐性模型下支原体肺炎发病风险均显著降低（P＜0.05），T 等位基因携带者支原体肺炎的发病风险相对于C 等位基因携带者显著降低0.57 倍（95%CI：0.43-0.76，P＜0.001）。见表1。

2.3 CRP 基因rs1205 位点SNP 与支原体肺炎严重程度相关性 以CC 基因型为参考，重症组CT 基因型和TT 基因型频率均显著低于轻症组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。以C 等位基因为参考，T等位基因携带者进展为重症支原体肺炎的概率显著降低0.41 倍（95%CI：0.27-0.63，P＜0.001）。见表2。

表1 CRP 基因rs1205 位点基因型和等位基因频率

表2 CRP 基因rs1205 位点基因型和等位基因频率与支原体肺炎严重程度相关性

2.4 血浆CRP 蛋白水平比较 轻症组和重症组支原体肺炎患儿血浆CRP 蛋白水平显著高于对照组，重症组血浆CRP 蛋白水平显著高于轻症组，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表3。

2.5 CRP 基因rs1205 位点SNP 与血浆CRP 蛋白水平相关性 分析205 例支原体肺炎患儿血浆CRP蛋白水平与CRP 基因rs1205 位点SNP 相关性，结果显示，CC 基因型携带者血浆CRP 蛋白水平最高，CT基因型其次，TT 基因型最低，差异有统计学意义（P＜0.01），见表4。

3 讨论

支原体肺炎是一种常见的儿科疾病，近年来发病率有上升的趋势，且呈现低龄化的趋势[12-13]。目前，支原体肺炎的发病原因并未完全阐明，炎性因子在其中的作用十分重要。CRP 是一种急性时相炎性反应蛋白，在炎症反应、病毒和细菌感染以及应激反应过程中均有显著性升高[14-16]。从相关研究中可知，CRP 在支原体肺炎的发病和转归中具有重要的作用，但目前关于CRP 基因多态性与支原体肺炎发病风险相关性的研究较少，本研究的目的是探讨CRP 基因3'UTR 区rs1205 位点SNP 与儿童支原体肺炎发病风险及其严重程度的相关性。

表3 三组患儿血浆CRP 蛋白水平比较（mg/L，）

表3 三组患儿血浆CRP 蛋白水平比较（mg/L，）

注：CRP 为C 反应蛋白；t1/P1 为对照组与轻症组比较；t2/P2 为对照组与重症组比较；t3/P3 为轻症组与重症组比较；轻症组、重症组为支原体肺炎患儿；对照组为急性上呼吸道感染患儿

表4 CRP 基因rs1205 位点不同基因型患儿血浆CRP 蛋白水平比较（mg/L，）

表4 CRP 基因rs1205 位点不同基因型患儿血浆CRP 蛋白水平比较（mg/L，）

注：CRP 为C 反应蛋白；t1/P1 为CC 基因型与CT 基因型比较；t2/P2 为CC 基因型与TT 基因型比较；t3/P3 为CT 基因型与TT 基因型比较

从本研究结果来看，携带CRP 基因rs1205 位点T 等位基因的受试者患支原体肺炎的风险较小，相对于携带C 等位基因的受试者，T 等位基因携带者患支原体肺炎的风险降低了0.57 倍（95%CI：0.43-0.76）。进一步研究发现，携带T 等位基因的支原体肺炎患儿血浆中CRP 蛋白水平显著低于C 等位基因携带者，与部分研究者发现rs1205 位点T 等位基因受试者血浆中CRP 蛋白水平显著低于C 等位基因携带者的相关研究结果一致[17-18]。分析原因，笔者认为rs1205 位点位于CRP 基因的3'UTR，可能突变的位点位于CRP 基因3'UTR 与微小RNA（miRNAs）相结合的区域，突变影响了miRNAs 对CRP 基因表达的调控作用，导致CRP 蛋白表达水平的改变。Arouca 等[19]研究显示，rs1205 位点CT/TT 基因型与较低的CRP 浓度相关，与本研究结果一致。笔者推测具体机制可能与调控miRNA 与rs1205 位点不同等位基因的结合效率差异较大，导致CRP 蛋白表达水平之间存在显著差异，还需体外模型进行验证。

此外，本研究发现，rs1205 位点SNP 与小儿支原体肺炎的严重程度相关，携带T 等位基因的患儿其严重程度显著低于C 等位基因携带者，显然携带T等位基因的支原体肺炎患儿血浆中CRP 蛋白水平显著低于C 等位基因携带者。由此说明，rs1205 位点SNP 与支原体肺炎的严重程度相关。

综上所述，CRP 基因rs1205 位点SNP 与儿童支原体肺炎发病风险及其严重程度相关，C 等位基因是支原体肺炎的高危因素，且携带C 等位基因的支原体肺炎患儿更容易进展为重症支原体肺炎。

但本研究也有一些不足之处，首先与CRP 表达水平相关的SNP 位点较多，本研究仅阐明了一个SNP 位点，尚且需要进一步研究；其次，与CRP 蛋白结构相关的SNP 位点也可能与支原体肺炎风险相关，也需要进一步证实；另外，需要设计体外研究证实其具体机制。