肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF、TB-RNA 和TB-DNA 联合检测对初治涂阴肺结核的快速诊断应用

徐俭朴 何 飞 陈园园 韩佳颖

结核病目前仍是威胁人类健康的主要传染性疾病之一，每年全球大约新发病例1000 万例以上[1]。涂阴肺结核在临床上较为常见，国内统计表明涂阴肺结核大约占总肺结核患者的66.43%，由于此类患者常规痰检无法检测出抗酸杆菌，在诊断上存在许多难点[2]。同时，传统结核病病原学检测敏感度低、时效长，已无法满足临床需要，因此急需寻找一种涂阴肺结核早期快速诊断方法[3]。近年来，电子气管镜局部肺泡灌洗技术在肺部疾病诊治中应用越来越普及，为取到合格病原学标本提供了方法。本研究通过观察肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）结核分枝杆菌检测/利福平耐药检测系统（Xpert MTB/RIF）、结核分枝杆菌RNA（TB-RNA）和结核分枝杆菌DNA（TB-DNA）联合检测技术对涂阴肺结核的诊断，从而寻找一种早期快速诊断涂阴肺结核的方法。

1 临床资料

1.1 一般资料 2018 年1 月—2018 年12 月浙江省中西医结合医院收治的疑似肺结核患者115 例，三次痰抗酸杆菌涂片均为阴性，进行肺部CT 和电子支气管镜检查，最终诊断为涂阴肺结核患者78 例作为观察组，均符合《中国结核病防治规划实施工作指南2008 年版》[4]中涂阴肺结核诊断标准。经进一步检查如经皮肺穿刺活检，血结核感染T 细胞检测（TSPOT）及诊断性抗感染治疗等排除肺结核患者37 例作为对照组。本研究经本院伦理委员会审批通过，所有患者均签署知情同意书。

1.2 纳入和排除标准 纳入标准：（1）肺部CT 和临床症状考虑为疑似肺结核患者，不同时间点三次抗酸杆菌涂片阴性；（2）年龄18～70 周岁；（3）既往无结核病史及相关治疗史；（4）无电子支气管镜检查相关禁忌证。排除标准：（1）研究实施前或过程中被确诊非结核分枝杆菌病患者；（2）合并重大心肺疾病；（3）存在电子支气管镜检查禁忌证；（4）重症肺结核患者。

2 研究方法

2.1 观察指标及方法 根据两组研究对象BALF 中Xpert MTB/RIF、TB-RNA 和TB-DNA 检测结果，计算观察组中各指标诊断涂阴肺结核的敏感性和特异性。敏感性=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%；特异性=真阴性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%。

2.1.1 电子支气管镜肺泡灌洗 所有研究对象均采用奥林巴斯电子支气管镜检查（型号BF-1T260 或BF-1T240），根据肺部CT 提示病灶所在部位进行定位灌洗，首先在灌洗的肺段经活检孔注入2%利多卡因1～2mL 局部麻醉，然后支气管镜顶端嵌入目标支气管段开口，经操作孔道快速注入室温灭菌生理盐水，总量约100mL，分次注入，每次20mL，最后立即负压吸引回收灌洗液送检TB-DNA、TB-RNA、Xpert MTB/RIF 和960 分枝杆菌快速培养。

2.1.2 BALF 标本Xpert MTB/RIF 检测 取BALF标本5mL 与SR 痰标本处理液（含氢氧化钠和异丙醇）按2：1 均匀混合后，室温静置15min，将混合液移入MTB/RIF 检测试剂盒（美国Cepheid 公司，批号1000079291）反应盒中，置于Gene Xpert 仪（GX-XVI，美国Cepheid 公司）中进行检测。

2.1.3 BALF 标本TB-RNA 及TB-DNA 检测 结核菌RNA 试剂盒是由上海仁度公司生产的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒（批号20180301），根据试剂盒说明在罗氏荧光定量聚合酶链反应核酸扩增（PCR）仪（Roche Cobas 480，美国罗氏公司）进行检测并记录结果；结核菌DNA 试剂盒是由北京博奥公司生产的结核分枝杆菌核酸试剂盒（批号20180303），根据试剂盒说明在实时荧光定量检测仪（SLAN-96S Real-Time PCR System 厦门致善生物科技有限公司）进行检测并记录结果。

2.1.4 观察组BALF 标本分枝杆菌液体培养 BALF标本分枝杆菌液体培养采用Bactec MGIT960 液体培养基（批号7233900、7272656，美国BD 公司）按照《结核病实验室标准化操作与网络建设》[5]中的操作程序进行。

2.2 统计学方法 应用SPSS 22.0 和Medcalc 15统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差（）表示，采用t 检验；计数资料采用χ2检验，如理论频数T＜5 但≥1，采用连续校正χ2检验，如理论频数＜1，采用Fisher'精确检验。计算各检测方法诊断效能采用ROC 曲线分析（Medcalc 15）。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 两组研究对象一般资料比较 观察组78 例，男44 例，女34 例，年龄（41.63±12.23）岁，病程（33.40±8.64）天。对照组37 例，男25 例，女12 例，年龄（42.21±11.41）岁，病程（31.11±9.73）天。两组研究对象年龄、病程比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3.2 两组研究对象BALF Xpert MTB/RIF、TB-RNA和TB-DNA 检测阳性率比较 观察组BALF Xpert MTB/RIF、TB-RNA 和TB-DNA 阳性率均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 两组研究对象BALF Xpert MTB/RIF、TB-RNA和TB-DNA 检测阳性率比较[例（%）]

3.3 观察组BALF 分枝杆菌培养与Xpert MTB/RIF、TB-RNA 和TB-DNA 检测阳性率比较 BALF分枝杆菌培养阳性率为32.05%（25/78），阳性率为67.95（53/78）。25 例阳性患者中，20 例Xpert MTB/RIF 阳性，22 例TB-RNA 阳性，23 例TB-DNA 阳性。53 例阴性患者中，23 例Xpert MTB/RIF 阳性，26 例TB-RNA 阳性，25 例TB-DNA 阳性。培养阳性组Xpert MTB/RIF、TB-RNA 和TB-DNA 阳性率均显著高于培养阴性组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 观察组BALF 分枝杆菌培养与Xpert MTB/RIF、TBRNA 和TB-DNA 检测阳性率比较[例（%）]

3.4 三种检测方法诊断涂阴肺结核的价值分析Xpert MTB/RIF 法、TB-RNA、TB-DNA 三种检测方法ROC 曲线比较，曲线下面积（AUC）联合检测组与Xpert MTB/RIF 差异有统计学意义（P＜0.05），与TBRNA 及TB-DNA 相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。联合检测组Youden 指数最高。三种检测方法的灵敏度、特异度及准确性见表3。

表3 三种检测方法诊断涂阴肺结核的敏感性和特异性分析

4 讨论

涂阴性肺结核患者临床表现不一，轻重各异，其中部分患者无症状，肺部影像学缺乏特异性，均给诊断造成一定难度[6]。传统的诊断方法如痰结核菌培养，其灵敏度较低，且耗时较长，往往需要数周时间，与临床结核病快速诊断的要求不符[7]。TB-RNA 检测是一项恒温扩增实时荧光检测技术，检测速度快，同时由于TB-RNA 只存在活菌中，结核菌死亡后RNA会很快发生降解，因此这种方法能够有效辅助诊断肺结核病,以及评估抗结核治疗疗效[8]。TB-DNA 检测是一种实时荧光聚合酶链反应法（PCR）检测技术，其灵敏度和特异度均较高，但它不能作为抗结核疗效评估，因为死菌DNA 在体内可以维持很长一段时间[9]。Xpert MTB/RIF 检测技术是一个快速结核菌检测平台，它是一种荧光定量PCR 体外诊断技术，最快2h 就能诊断出结果。近年研究证实该技术在涂阴肺结核诊治中具有较高的灵敏度，临床应用越来越成熟，但这种方法亦不能作为抗结核疗效评估[10]。

观察组中培养阴性组三种检测方法的阳性率均显著低于培养阳性组（P＜0.01），与临床认知是一致的。与对照组比较，观察组三种检测方法阳性率均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。联合检测组诊断的灵敏度88.00%，特异度为58.49%，较Xpert MTB/RIF 有显著提高（P＜0.05），而与TB-RNA检测组及TB-DNA 检测组无显著差异，考虑是否与样本数量不足有关。

研究显示，Xpert MTB/RIF、TB-RNA 和TB-DNA联合检测可准确、有效、快速地明确涂阴肺结核的诊断，缩短诊断时间，使患者能够得到及时治疗，同时TB-RNA 还可作为抗结核治疗疗效的评估，指导治疗，故三种方法联合检测值得临床推广。