香菇多糖脱蛋白工艺及其抗氧化活性研究

（江苏农牧科技职业学院动物药学院，江苏泰州225300）

香菇又称为香菌、花菇、香蕈，是一种药食同源的中药材。香菇的有效成分主要包括香菇多糖、香菇嘌呤、微量元素等[1]，其中香菇多糖是香菇的主要活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤和抗病毒等作用[2-6]。香菇中多糖与蛋白质共存，两者均是香菇细胞的重要组分。热水浸提法等方法在提取出香菇中的水溶性多糖类成分的同时，部分热稳定性强的蛋白质及其它水溶性成分也会一起转移至提取液中。目前，传统的Sevag法、离子交换色谱法及酶法等多糖脱蛋白工艺复杂，效率不高[7-8]。低共熔溶剂（deep eutectic solvents，DES）是一种环境友好型的类离子液体，具有性质稳定、选择性强、价格低廉等优点，并在天然产物、金属离子、有机物等分离领域显示出良好的应用前景[9-11]。本文采用DES与无机盐溶液构成双水相体系（aqueous twophase system，ATPS），为香菇多糖脱蛋白质提供一种新型有效的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香菇：西峡县雷氏菇品购销有限公司。将香菇烘干、粉碎，过20目筛，备用。

无水葡萄糖对照品、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250：国药集团化学试剂有限公司；其余试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

AL204电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HH-1数显恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司；UV-1800PC-DS2紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；JJ-1精密增力电动搅拌器：国华电器有限公司；XMTD-8222电热恒温鼓风干燥箱：上海姚氏仪器设备厂；SHZ-DⅢ循环水式真空泵：河南省予华仪器有限公司；HK-02A多功能粉碎机：上海烨昌食品机械有限公司；80-2台式电动离心机：金坛市杰瑞尔电器有限公司。

2 试验方法

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

参照文献[12]，以无水葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸显色法测定多糖的浓度，以吸光度（y）对葡萄糖浓度（x）回归，得回归方程为y=0.014 2x-0.006 9（R2=0.996 5），表明在 10.56 μg/mL～52.8 μg/mL 范围内葡萄糖浓度与其吸光度呈良好的线性关系。

2.2 考马斯亮蓝标准曲线的绘制

参照文献[13]，以牛血清白蛋白为对照品，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。以蛋白质浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度（A595）为纵坐标，得回归方程y=0.003 49x-0.005 53（R2=0.995 6），表明在 43.42 μg/mL～203.02 μg/mL范围内蛋白质浓度与其吸光度呈良好线性关系。

2.3 香菇多糖水提液的制备

称取香菇粉35 g，加500 mL蒸馏水，50℃水浴搅拌提取约2 h，抽滤得到香菇多糖水提液，4℃保存。

2.4 香菇多糖水提液中蛋白质含量测定

精密移取2.00mL香菇多糖水提液，按照2.2进行测算，得出香菇多糖水提液中蛋白质浓度为151.44μg/mL。以下试验均采用此浓度的香菇多糖水提液。

2.5 低共熔溶剂DES的合成

参考文献[14]，分别合成 DES 1[氯化胆碱（0.1 mol，13.962 g）和尿素（0.2 mol，12.012 g）]、DES 2[（氯化胆碱（0.1 mol，13.962 g） 和甲基脲 （0.2 mol，14.816 g）]、DES 3[（氯化胆碱（0.1 mol，13.962 g）和丙三醇（0.2 mol，18.418 g）]、DES 4[（氯化胆碱（0.1 mol，13.962 g）和乙二醇（0.2 mol，12.414 g）]4 种低共熔溶剂。

2.6 K2HPO4溶液的配制及DES-盐双水相体系的构建

称取一定量K2HPO4溶于50 mL蒸馏水中，配制成不同浓度的K2HPO4溶液。向试管中加入一定量的DES，再加入适量K2HPO4溶液，充分振荡、混合后，静置，观察是否成为清晰的两相，研究体系成相规律。

2.7 蛋白质的脱除及含量测定

向刻度离心管中加入3 mL DES、3 mL K2HPO4溶液及2 mL香菇多糖水提液，2 000 r/min离心萃取30 min。操作结束后，将离心管取出，待两相完全分离后，分别读取上相和下相的体积，并用苯酚-硫酸显色法和考马斯亮蓝法分别测定上、下两相中多糖和蛋白质的浓度。

蛋白质的脱除率（E）按式（1）计算。

式中：ct1和cb1分别为萃取完全后蛋白质在上相（DES相）和下相（无机盐相）中的浓度，μg/mL；Vt和Vb分别为双水相上相和下相的体积，mL；R为该双水相体系上下相体积比。

香菇多糖回收率（Y）按式（3）计算。

式中：ct2和cb2分别为萃取完全后多糖在上相（DES相）和下相（无机盐相）中的浓度，μg/mL；Vt和 Vb分别为双水相上相和下相的体积，mL。

2.8 香菇多糖抗氧化活性研究

采用DPPH法[15-18]，准确移取1.00 mL脱蛋白后的香菇多糖溶液，加入预先配置好的4 mL 0.15 mmol/L的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH自由基）甲醇溶液，摇匀后暗处放置30 min，以样品溶剂为空白，测定其在515 nm波长处测定其吸光度A，同时测定样品溶液在515 nm处的吸光度A0及DPPH甲醇溶液在515 nm处的吸光度A1，每个样品重复3次。

3 结果与分析

3.1 DES种类的筛选

将氢键受体（氯化胆碱）与氢键供体（尿素、甲基脲、丙三醇、乙二醇）按照物质的量之比1∶2合成4种低共熔溶剂，与0.5 g/mL K2HPO4溶液组成双水相体系，成相效果如图1所示。

图1DES-K2HPO4成相图Fig.1 Photo of Four DES-K2HPO4aqueous two-phase systems

据图1可知，试管1（氯化胆碱/丙三醇DES 1-K2HPO4）和试管 4（氯化胆碱/尿素 DES 4-K2HPO4）成相效果较好。

按2.7方法，比较4种DES构建的双水相对香菇多糖水提液中蛋白质的脱除率，结果见表1。

表1 DES种类对蛋白质分配系数和脱除率的影响Table 1 Effect of DES types on protein partition coefficient and removal rate

由表1可知，相同条件下，DES 1（氯化胆碱/丙三醇）双水相对香菇多糖蛋白质的脱除率最高，最高脱除率可达85.41%，且DES 1-K2HPO4成相效果较好，由此，在后续试验中选用DES 1（氯化胆碱/丙三醇）构建双水相。

3.2 双水相体系成相规律

3.2.1 K2HPO4浓度对双水相体系的影响

向3 mL氯化胆碱/丙三醇（物质的量之比1∶2）DES中加入3 mL不同浓度的K2HPO4溶液。当K2HPO4浓度由0.3 g/mL增加到0.8 g/mL时，上相（含DES）体积（Vt）逐渐变少，下相（含K2HPO4）体积（Vb）逐渐增加，上下相体积比R（Vt/Vb）显著减小。结果见图2。

图2 K2HPO4浓度对双水相体系的影响Fig.2 Effect of K2HPO4concentration on aqueous two-phase system

3.2.2 DES加入量对双水相体系的影响

向 K2HPO4溶液（0.5 g/mL，3 mL）中加入一定量的氯化胆碱/丙三醇（物质的量之比1∶2）DES，当DES加入量由1.8 mL增加至3.8 mL时，富含DES的上相体积（Vt）逐渐增大，富含下相无机盐的体积（Vb）逐步减少，上下相体积比R逐渐变大，结果见图3。

图3 DES加入量对双水相体系的影响Fig.3 Effect of DES addition on aqueous two-phase system

由图3可见，K2HPO4的浓度和DES的加入量对双水相成相体系有影响，进而对蛋白质的脱除率有影响。因此可以通过调节K2HPO4的浓度和DES的加入量来获得满意的脱除率。

3.3 单因素试验

3.3.1 氯化胆碱/丙三醇物质的量比对蛋白质脱除率的影响

以 DES 1（3 mL）与 K2HPO4（0.5 g/mL，3 mL）构建双水相体系，向其中加入香菇多糖水提液2.00 mL，2 000 r/min离心30 min，DES1物质的量比对双水相体系中香菇多糖蛋白质萃取行为的影响如表2所示。

由表2可知，蛋白质在双水相体系分配系数K1大多超过1，而香菇多糖在双水相体系分配系数K2较小，说明蛋白质富集在上相，多糖富集在下相。在K2HPO4和香菇多糖水提液的量一定时，当氯化胆碱/丙三醇物质的量比为1∶2时，香菇多糖蛋白质拥有最大的脱除率，可达87.09%。在后续的单因素试验中，选用氯化胆碱/丙三醇（物质的量之比1∶2）制备低共熔溶剂。

表2 DES 1物质的量比对E、Y的影响Table 2 Effect of the ratio of DES 1 substance on E and Y

3.3.2 K2HPO4溶液浓度对蛋白质脱除率的影响

以DES 1（物质的量之比1∶2，3 mL）与K2HPO4（3 mL）构建双水相体系，向该体系中加入2mL香菇多糖水提液，离心参数设置同3.3.1，K2HPO4溶液的浓度对该双水相体系中的香菇多糖蛋白质脱除率的影响如表3所示。

表3 K2HPO4溶液浓度对E、Y的影响Table 3 Effect of K2HPO4solution concentration on E and Y

由表3可知，当K2HPO4浓度在0.3 g/mL～0.6 g/mL范围内，随着其浓度的增加，蛋白质的脱除率随之增高，这是因为下相空间的紧密度会影响蛋白质的脱除率，从而促进蛋白质进入到上相DES相中[14]。当K2HPO4浓度为0.6 g/mL时香菇多糖蛋白质拥有最大的脱除率，可达87.84%。K2HPO4浓度超过0.6 g/mL时，随着K2HPO4浓度的增加，脱除率反而下降，这是因为过高浓度的K2HPO4，导致了部分蛋白质变性[19]。另外，处在下相的K2HPO4与位于上相的DES相互竞争水分子，DES中的含水量逐渐下降，导致蛋白质的脱除率下降。在后续的单因素试验中，将K2HPO4的浓度确定为0.6 g/mL。

3.3.3 DES加入量对蛋白质脱除率的影响

以DES1（物质的量之比1∶2）与K2HPO4（0.6 g/mL，3 mL）构建双水相体系，香菇多糖水提液的加入量为2 mL，按照2 000 r/min的转速离心萃取30 min，研究DES的加入量对双水相体系中香菇多糖蛋白质萃取行为的影响，数据处理结果如表4所示。

表4 DES加入量对E、Y的影响Table 4 Effect of DES addition on E and Y

由表4可知，当DES的加入量在1.8 mL～2.6 mL范围内，随着DES量的增加，香菇多糖蛋白质的脱除率逐渐上升，这是因为DES簇集体的形成逐渐增多[13]，有利于蛋白质的萃取。当DES的加入量超过2.6 mL时，继续增加DES的量，脱除率没有明显上升，所以在后续单因素试验中，DES的加入量为2.6 mL。

3.3.4 萃取时间对蛋白质脱除率的影响

以 DES 1（物质的量之比 1 ∶2，2.6 mL）与 K2HPO4（0.6 g/mL，3 mL）构建双水相体系，向其中加入2 mL香菇多糖水提液，离心机的转速固定为2 000 r/min。研究离心萃取时间对双水相体系中香菇多糖蛋白质萃取行为的影响，数据处理结果和香菇多糖蛋白质的脱除率随萃取时间的变化关系如表5所示。

表5 萃取时间对E、Y的影响Fig.5 Effect of extraction time on E and Y

由表5可知，当萃取时间由15 min增加到30 min时，香菇多糖蛋白质的脱除率呈上升趋势，继续增加萃取时间，香菇多糖蛋白质的脱除率E基本持平，未出现明显增加，多糖回收率Y始终维持在较高水平。结果表明：萃取时间为30 mim时，香菇多糖蛋白质几乎萃取完全，继续增加萃取时间，对提升脱除率无明显影响。

3.4 正交试验

在单因素试验的基础上，以DES 1物质的量比（A）、K2HPO4浓度（B）、DES加入量（C）、萃取时间（D）为因素，采用L9（34）正交进行试验，正交设计见表6，所得结果见表7。以蛋白质脱除率为指标，优化萃取最佳工艺参数。

表6 正交试验因素水平表Table 6 Horizontal table of factors in orthogonal test

表7 正交试验结果与分析Table 7 Orthogonal test results and analysis

由极差R分析可知，4个因素对香菇多糖蛋白质脱除率的影响程度大小为：A（DES物质的量比）＞C（DES量）＞B（无机盐浓度）＞D（萃取时间）。氯化胆碱/丙三醇低共熔溶剂与K2HPO4组成的双水相体系萃取香菇多糖蛋白质最优试验条件为A2B2C2D2，即DES物质的量比 1 ∶2、0.6 g/mL K2HPO43 mL，2.6 mL DES，萃取时间30 min。

3.5 验证试验

在A2B2C2D2条件下进行DES-K2HPO4双水相体系脱除香菇多糖中蛋白质的验证试验，试验结果见表8。

表8 验证试验Table 8 Demonstration test

据表8可知，在A2B2C2D2条件下蛋白质平均脱除率高达90.8%，多糖平均回收率为98.0%。与表5在同等水平下所得脱除率及回收率相近，表明该条件下试验结果可靠。

3.6 香菇多糖DPPH自由基清除能力

香菇多糖对DPPH自由基的清除作用见图4。

图4 香菇多糖对DPPH自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effect of lentinan on DPPH free radical

由图4可知，在脱蛋白的香菇多糖水提液的质量浓度为2.4 mg/mL时，随着稀释倍数的增大，DPPH自由基清除率逐渐减小，即在一定浓度范围内，DDPH自由基清除率随着香菇多糖质量浓度的增大而升高。

4 结论

本文通过热水提取法制备香菇多糖溶液，采用低共溶剂（DES）-K2HPO4双水相体系（ATPS）将香菇水提液中的多糖与蛋白质进行分离萃取研究，通过单因素试验及正交试验，得出香菇多糖水提液蛋白质脱除的最优工艺参数：以氯化胆碱/丙三醇（物质的量之比1 ∶2，2.6 mL）、K2HPO4（0.6 g/mL，3 mL） 构建双水相体系，加入2 mL香菇多糖水提液，萃取30 min后对香菇多糖蛋白质的脱除率高达90.8%，香菇多糖回收率为98.0%。脱蛋白后的香菇多糖具有较好的清除能力，且清除能力随着香菇多糖质量浓度的增大而升高。

传统脱蛋白的方法主要有sevag法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法等，这类方法需消耗大量的有机溶剂，或需在低温下进行，对操作环境要求较高。而将DES与无机盐构成的双水相体系，萃取温度接近室温20℃，操作条件简单，无污染，蛋白质萃取率（脱除率）及多糖回收率均能达到较高的水平，是一种绿色的萃取方法。