真空浸渍辅助L-半胱氨酸处理对贮藏期鲜切马铃薯的护色作用

（山西师范大学食品科学学院，山西临汾041004）

马铃薯作为世界四大主粮之一，是碳水化合物、膳食纤维、维生素及矿物质等营养物质的良好来源。全球有100多个国家种植马铃薯，总产量超过3.0×108t，并呈逐年上升趋势[1-2]。马铃薯除鲜食之外，还可制作成薯片、薯条、薯泥等多种加工产品，但马铃薯在切分、削皮等加工过程中，由于机械性损伤而导致酶促褐变的产生，对其感官品质和营养价值产生不利影响[3-5]。酶促褐变是由于多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）氧化酚类化合形成邻醌，邻醌再聚合产生黑褐色物质。在完整的植物细胞中，氧化酶类和多酚存在于不同的细胞器中，因而不会发生氧化反应，但细胞组织破坏时，这种隔离被打破，从而引发酶促褐变[6]。

化学方法是控制鲜切果蔬酶促褐变的主要手段之一，如采用柠檬酸[7]、抗坏血酸及其衍生物[7-8]、EDTA[9]、曲酸[10]处理，或采用多种护色剂组合方式处理[8，11]。L-半胱氨酸（L-cysteine，L-cys）是一种生物体内常见的含硫氨基酸，广泛用于医药、食品、化妆品的加工制造。诸多研究表明，L-cys是酶促褐变最有效的抑制剂之一，通过与醌中间体重新作用形成稳定无色化合物，防止酶促褐变的形成[12]。但也有研究表明，L-cys可直接作用于PPO，降低其活性而抑制酶促褐变的发生[13-14]。陈晨等[14]研究了L-cys对鲜切苹果褐变控制的生理机制，结果表明，与蒸馏水处理（对照组）相比，在贮藏初期L-cys处理降低了鲜切苹果的PPO活性，显著抑制了鲜切苹果的褐变。廖春丽等[15]研究了L-cys对马铃薯中PPO活性的影响，结果表明，L-cys对马铃薯活性抑制作用明显，随着L-cys浓度增大，酶活性降低幅度越大。可见L-cys能够有效控制鲜切果蔬酶促褐变，但L-cys对控制贮藏过程中鲜切马铃薯酶促褐变的生理机制仍缺乏系统研究。

真空浸渍（vacuum impregnation，VI）作为食品加工中常用的非热物理辅助方法，广泛用于食品加工中[16-17]。本研究拟采用VI辅助L-cys，在一定的VI条件下，将L-cys溶液浸透到鲜切马铃薯细胞间隙内，以期达到抗褐变效果。通过分析鲜切马铃薯在4℃、15 d贮藏过程中，褐变指数（browning index，BI）、PPO、过氧化物酶（peroxidase，POD）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）活性、总酚含量及抗氧化活性等的变化，系统评价L-cys对鲜切马铃薯的护色效果，以期为鲜切果蔬护色研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马铃薯（晋薯16号）：山西临汾尧丰市场；L-半胱氨酸（食品级）：广东味多美食品配料有限公司；邻苯二酚（分析纯）：南京化学试剂股份有限公司；福林酚（分析纯）：上海源叶有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVPP）：天津市科密欧有限公司；硼酸、硼砂（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；愈创木酚、水杨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钠等：均为分析纯，天津市光复科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

2XZ-1型真空泵：上海万经泵业制造有限公司；NR110型精密色差仪：深圳市三恩时科技有限公司；H1805R型台式高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；752型紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；LC-Q01型切片机：佛山市顺德区韩泰电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鲜切马铃薯的VI处理

马铃薯经去皮、切片（0.3 cm），浸泡于300 mL L-cys（0.7 g/L）溶液中，再置于真空浸渍装置内，在真空度15.11×10-3MPa条件下处理10 min，恢复大气压状态后再浸渍处理10 min。将VI处理后的样品拭干后，均匀放入托盘中并用聚乙烯保鲜膜包好，置于4℃冷库中贮藏15 d。定期取样用于测定分析生理生化变化。

1.3.2 鲜切马铃薯BI值的测定

利用色差仪测定鲜切马铃薯L*、a*、b*值，它是代表物体颜色的色度值，也就是颜色空间坐标，其中L*值表示样品的明亮程度，即明度差，a*值样品的：红绿色调差，b*值代表样黄蓝色调差。根据陈晨等[14]的研究计算鲜切马铃薯BI值。

1.3.3 相关酶活性的测定

PPO活性是参照程丽林等[18]的方法测定。酶活性的定义：以单位酶液每分钟内吸光度值每增加0.01为一个活力单位（U/g）。

POD活性是参照Terefe等[19]的方法测定，并稍作改动。称取5 g鲜切马铃薯，加入20 mL磷酸盐缓冲溶液（磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，0.1 mol/L、pH 6.8）研磨，离心 15 min（12 000 r/min、4℃），上清液即为粗酶液。分别取1 mL的磷酸缓冲溶液、1 mL的愈创木酚溶液（0.02 mol/L）、2 mL的过氧化氢溶液（0.02 mol/L）及 1 mL酶液，加入到试管中。对照组加入1 mL超纯水代替酶液。将反应液充分摇匀，在470 nm处测定吸光值。每15 s记录一次数据，共记录3 min。以单位酶液每分钟吸光度值每增加0.01为一个活力单位（U/g）。

PAL活性是参照王礼群等[20]的方法测定，并稍作改动。分别称取10 g鲜切马铃薯、0.8 g PVPP，加入32 mL硼酸缓冲液（pH 8.8，含0.4 μL/mL的巯基乙醇）冰浴研磨，离心 15 min（10 000 r/min，4 ℃），上清液即为粗酶液。试管中分别加入2 mL硼酸缓冲液、2 mL L-苯丙氨酸（0.02 mol/L）及0.5 mL酶液，空白组以0.5 mL缓冲液替代酶液，在290 nm处测定吸光值。再将反应液水浴（37℃）30 min，加入 0.5 mL盐酸（0.6 mol/L）终止反应，冷却后于290 nm处测定吸光值。以1 h内A290增加0.01为PAL的一个活性単位。

1.3.4 总酚含量的测定

称取10 g鲜切马铃薯，加入15 mL、80%的乙醇冰浴研磨，离心 15 min（10 000 r/min、4 ℃），再将上清液通过0.45 μm过滤器得到提取液备用。参照Piccolella等[21]的方法测定总酚含量。

1.3.5 抗氧化能力的测定

以鲜切马铃薯对羟基自由基的清除能力，作为抗氧化能力的指标，并参照齐美娜[22]的方法测定羟基自由基的清除能力。

1.3.6 数据处理与统计分析

采用IBM SPSS Statistics 20.0软件对试验数据进行统计学处理，结果以平均值±标准偏差表示。采用Duncan多重比较法进行差异显著性分析，显著性以p＜0.05为显著。采用Origin 2018软件绘图。

2 结果与讨论

2.1 L-cys处理对鲜切马铃薯BI值的影响

通过BI值可以反映出鲜切马铃薯的褐变程度，并能直观判断出其外观品质。L-cys处理对贮藏期鲜切马铃薯BI值的影响见图1。

图1 L-cys处理对贮藏期鲜切马铃薯BI值的影响Fig.1 Effect of L-cys treatment on BI value of fresh-cut potatoes during storage

如图1所示，在贮藏期间，试验组与对照组鲜马铃薯BI值总体呈上升趋势，但试验组BI值显著低于对照组BI值（p＜0.05），表明在贮藏期内L-cys处理延缓了鲜切马铃薯褐变程度。在贮藏前3 d，对照组鲜切马铃薯BI值显著上升，随后呈平缓上升趋势。试验组在前9 d的贮藏期内，鲜切马铃薯BI值呈缓慢上升趋势，但贮藏后期呈急促上升趋势，证明在0～9 d内，L-cys处理对鲜切马铃薯酶促褐变的控制作用最明显。

2.2 L-cys处理对鲜切马铃薯相关酶活性的影响

鲜切马铃薯酶促褐变程度与PPO活性强弱密切相关，L-cys对鲜切马铃薯PPO活性的影响如图2所示。

图2 L-cys处理对贮藏期鲜切马铃薯PPO活性的影响Fig.2 Effect of L-cys treatment on PPO activity of fresh-cut potatoes during storage

试验组和对照组鲜切马铃薯PPO活性，随贮藏时间的延长均呈先上升后下降趋势，但试验组PPO活性显著低于对照组（p＜0.05）活性。在整个贮藏期，对照组的PPO活性变化趋势与陈晨等[14]的研究结果相似，在贮藏第9天时达到最大值（62.41 U/g）。试验组PPO活性在贮藏前期呈平缓上升趋势，在第4天时达到最高（41.11 U/g），随后呈平缓下降趋势。目前L-cys对鲜切果蔬褐变的抑制机理尚有争论，但Ali等[7]研究认为L-cys是一种高效的PPO抑制剂，它对膜PPO活性具有较强的抑制作用。L-cys的-SH基团对PPO活性中心铜离子具有亲和力，通过对PPO活性中心的结构性修饰而改变其活性。在本研究中，贮藏期内L-cys处理延迟了鲜切马铃薯PPO活性的上升，进而可降低酶促褐变的程度。

POD是一种存在于植物体中活性较高的酶，与呼吸作用、光合作用及氧化作用密切相关。在鲜切果蔬中，POD可以利用H2O2释放出的O2氧化酚类物质，引发酶促褐变反应。曲酸处理对贮藏期鲜切马铃薯POD活性的影响见图3。

图3 L-cys处理对贮藏期鲜切马铃薯POD活性的影响Fig.3 Effect of L-cys treatment on POD activity of fresh-cut potatoes during storage

由图3可知，在贮藏0～9 d，试验组鲜切马铃薯POD活性呈先下降后上升趋势，除第6天外，试验组POD活性显著低于对照组（p＜0.05）。但随着贮藏时间延长，对照组POD活性呈急促上升趋势，试验组则呈下降趋势，这可能与贮藏期的微生物侵染有关，贮藏后期微生物侵染程度加大，从而诱导对照组鲜切马铃薯POD活性升高，也可能是贮藏过程中产生了新的POD同工酶[23]。一般许多果蔬组织中POD活性都伴随机械性损伤而升高，但在贮藏期内，试验组POD活性并没出现大幅上升现象，说明L-cys处理有效抑制了鲜切马铃薯POD活性升高。

PAL主要存在于高等植物、酵母、菌类等生物体内，为多种酚类化合物及类黄酮终产物提供前体，可催化L-cys脱去氨而促进酚类化合物的合成。曲酸处理对贮藏期鲜切马铃薯PAL活性的影响见图4。

图4 L-cys处理对贮藏期鲜切马铃薯PAL活性的影响Fig.4 Effect of L-cys treatment on PAL activity of fresh-cut potatoes during storage

由图4可知，在贮藏期内试验组和对照组鲜切马铃薯PAL活性均呈先上升趋势，这可能是切割伤害诱导了贮藏过程中鲜切马铃薯PAL活性升高[24]，但在整个贮藏期内试验组PAL活性均显著低于对照组（p＜0.05），说明L-cys处理（试验组）可以延缓鲜切马铃薯PAL活性的上升，有利于控制鲜切马铃薯酚类化合物的合成。

2.3 L-cys处理对鲜切马铃薯总酚含量的影响

多酚化合物是果蔬中重要的抗氧化物质之一，同时也是PPO、POD的底物，参与果蔬的酶促褐变反应[25]。L-cys处理对贮藏期鲜切马铃薯多酚含量的影响见图5。

图5 L-cys处理对贮藏期鲜切马铃薯多酚含量的影响Fig.5 Effect of L-cys treatment on polyphenol content of fresh-cut potatoes during storage

如图5所示，试验组和对照组鲜切马铃薯总酚含量都呈上升趋势。在贮藏前6 d，试验组总酚含量显著低于对照组（p＜0.05），但随着贮藏时间的延长则相反。贮藏期间的鲜切马铃薯PAL活性逐渐升高，促进了酚类化合物的合成，因而两组的总酚含量都呈上升趋势。但随贮藏时间延长（9 d～15 d），由于试验组鲜切马铃薯PPO活性显著低于对照组（p＜0.05），这可能是造成试验组总酚含量高于对照组的原因（p＜0.05）。

2.4 L-cys处理对鲜切马铃薯抗氧化能力的影响

羟基自由基是自然界中仅次于氟的强氧化剂，具有极强的氧化能力。L-cys处理对贮藏过程中鲜切马铃薯羟基自由基清除能力的影响见图6。

图6 L-cys处理对贮藏过程中鲜切马铃薯羟基自由基清除能力的影响Fig.6 Effect of L-cys treatment on hydroxyl radical scavenging activity of fresh-cut potatoes during storage

如图6所示，在贮藏期间，试验组鲜切马铃薯对羟基自由基清除能力呈上升趋势，对照组则呈先上升后下降趋势。在贮藏后期（12 d～15 d），试验组对羟基自由基清除能力显著高于对照组（p＜0.05），这可能与试验组总酚含量在贮藏后期的合成和积累有关[26]。总体来说，贮藏期间L-cys处理诱导了鲜切马铃薯中总抗氧化物质的合成和积累，其清除羟基自由基能力得到了提高，在一定程度上可减轻活性氧对马铃薯细胞组织产生的氧化损伤。

3 结论

目前诸多国内外学者认为，L-cys处理对果蔬酶促褐变控制机理有两种可能的形式。一种是硫醇类化合物可以结合PPO分子活性中心的铜离子从而改变其活性。另一种是硫醇类化合物可在酶促反应过程中与产生的醌类发生非酶催化反应，而形成一种化学性质稳定的无色化合物[7，14，23，27]。在本研究中，与对照组比较，L-cys处理对贮藏期鲜切马铃薯PPO和POD活性均有显著抑制作用。说明L-cys可能与马铃薯酶蛋白不可逆地结合，从而抑制其酶促褐变反应[13]。但也有研究认为L-cys能与酶促褐变产物醌类化合物反应生成稳定的无色化合物，而防止醌类氧化形成有色物质[28]。根据本研究结果，认为贮藏期鲜切马铃薯BI的变化由以上两种机制共同作用的结果。另外，切割损伤诱导了贮藏期鲜切马铃薯PAL活性的升高，随之总酚含量也呈升高趋势，但与对照组相比，L-cys处理显著抑制了贮藏期鲜切马铃薯PAL活性（p＜0.05）。由此可见，通过L-cys处理可延缓鲜切马铃薯贮藏期间的酶促褐变，进而可保护其贮藏品质。