迷迭香提取物对自由基诱导蛋白质、油脂及DNA氧化的抑制作用

刘胜男，余敏敏，郭晓莉，潘菁菁，相启森，*

（1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南郑州450001；2.食品生产与安全河南省协同创新中心，河南郑州450001）

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一类含有不成对电子的氧原子及原子团，包括超氧阴离子（O2-）、羟自由基（·OH）和过氧化氢（H2O2）等[1]。研究显示，机体过量产生的ROS会引发蛋白质氧化、脂质过氧化和DNA氧化损伤等，进而诱发人体多种疾病[2-3]。例如，胡静等[4]研究发现氧化应激可能会诱发天疱疮，Ram等[5]发现ROS诱导的DNA氧化损伤与阿尔兹海默症等神经退行性疾病的发生密切相关。为了降低氧化应激对机体造成的损伤，一些天然抗氧化剂受到研究者的广泛关注。研究证实，儿茶素、没食子酸、植物多酚等具有较强的清除自由基能力及抗衰老、抗癌、消炎及抗氧化等功能[6-8]，能够有效预防和减缓氧化应激反应的发生。

迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）是一种原产于地中海沿岸的天然香料植物，是目前广泛应用的食品添加剂[9]。迷迭香含有的迷迭香酸、迷迭香酚、鼠尾草酸和鼠尾草酚等已被证实具有抗氧化、抗菌、消炎和抗肿瘤等生理活性功能，但是在生物大分子和油脂氧化损伤抑制作用方面的研究却相对较少[9-12]。因此本研究通过Cu2+/H2O2、2，2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐[2，2'-azobis（2-amidinopropane）hydrochloride，AAPH]诱 导牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）氧化损伤，FeSO4、偶氮二异庚腈 [2，2'-azobis （2，4-di-methylvaleronitrile），AMVN]诱导亚油酸（linoleic acid，LA）氧化损伤以及AAPH诱导鲱鱼精DNA（herring sperm DNA，hsDNA）氧化，研究在此过程中迷迭香提取物对氧化损伤的抑制作用，为迷迭香在抗氧化功能食品中的应用提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

迷迭香提取物：食品营养与安全实验室自制；亚油酸（linoleic acid，LA）、2，2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（AAPH）和偶氮二异庚腈（AMVN）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、鲱鱼精DNA（hsDNA）、考马斯亮蓝R-250：北京索莱宝科技有限公司；β-巯基乙醇、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、N，N'-亚甲双丙烯酰胺、甘氨酸、N，N，N'，N'-四甲基二乙胺（TEMED）、异丙醇、三羟甲基氨基甲烷、溴酚蓝、过硫酸铵和二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：上海麦克林生化科技有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）：北京百灵威科技有限公司；CuSO4·5H2O、30%双氧水、冰乙酸和 FeSO4·7H2O：天津市大茂化学试剂厂；丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

PowerPacTM通用电泳仪电源、Mini-PROTEANTetra电泳槽、ChemiDocTMXRS+化学发光成像系统：美国Bio-Rad公司；5427R型高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；Multiskan GO型全波长酶标仪：美国Thermo Fisher Scientific公司；2450型紫外-可见分光光度计：日本Shimadzu公司；HH-8J型恒温水浴锅：常州润华电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 迷迭香提取物对Cu2+/H2O2诱导蛋白氧化和羰基化的影响

在终浓度为2 mg/mL的BSA溶液（pH6.0、0.2 mol/L PBS 溶解） 中加入 100 μL 不同浓度（0、25、50、100、200、500 μg/mL）的迷迭香提取物溶液，混匀后依次加入终浓度为400 μmol/L和10 mmol/L的CuSO4溶液和H2O2溶液，反应总体积为1 mL，封口后置于37℃水浴反应90 min。反应结束后，采用10%分离胶进行SDSPAGE分离蛋白，考马斯亮蓝R-250染色法进行染色，检测BSA氧化损伤程度，采用DNPH比色法检测BSA羰基含量。

1.3.2 迷迭香提取物对AAPH诱导蛋白氧化和羰基化的影响

在终浓度为2 mg/mL的BSA溶液中加入100 μL不同浓度的迷迭香提取物溶液，混匀后加入终浓度为100 mmol/L的 AAPH 溶液（pH 7.4，PBS溶解），反应总体积为1 mL，封口置于37℃水浴反应4 h。反应结束后，测定BSA的氧化损伤程度和羰基含量。

1.3.3 BSA氧化损伤程度测定

取50 μL反应样品，分别加50 μL 5×上样缓冲液混匀后沸水浴5 min，采用10%分离胶分离蛋白，经考马斯亮蓝R-250溶液（1 g/L）染色30 min，脱色液脱色过夜，采用ChemiDocTMXRS+化学发光成像系统进行成像并使用Image Lab软件对蛋白条带进行半定量分析。

1.3.4 BSA羰基含量测定

取1 mL反应液加入3 mL 0.01 mol/L DNPH溶液，混匀后于室温（25℃）下避光反应30 min。反应结束后加入4 mL、20%TCA溶液，混匀后4 000 r/min离心10min。弃上清液后，加入3mL乙醇-乙酸乙酯混合液（体积比1∶1）进行洗涤，重复3次。最后一次离心后弃上清液，加入2 mL、6 mol/L盐酸胍溶液，混匀后采用紫外-可见分光光度计测定其在370 nm处吸光值。蛋白羰基含量（nmol/mg）使用摩尔吸光系数22 000 mol/（L·cm）来计算。

1.3.5 迷迭香提取物对FeSO4诱导亚油酸氧化的影响

在终浓度为1 mmol/L的LA（乙醇溶解）中，加入100 μL不同浓度的迷迭香提取物溶液，混匀后再加入终浓度为100 μmol/L的FeSO4溶液，反应总体积为1 mL，封口后于37℃水浴避光反应24 h。反应结束后，以共轭二烯和MDA含量表示亚油酸脂质氧化水平。参照Esterbauer等报道的方法检测共轭二烯含量[13]。用紫外-可见分光光度计测定样品在233 nm处的吸光度，并根据共轭二烯的摩尔吸光系数2.8×104L/（mol·cm）计算共轭二烯含量，结果以μmol/L表示。采用MDA试剂盒测定样品中MDA含量，结果表示为nmol/mL。

1.3.6 迷迭香提取物对AMVN诱导亚油酸氧化的影响

在终浓度为1 mmol/L的LA中，加入100 μL不同浓度的迷迭香提取物溶液，混匀后再加入终浓度为1 mmol/L的AMVN溶液（甲醇溶解），反应总体积为1 mL，封口后于37℃水浴避光反应12 h。反应结束后，以共轭二烯和MDA含量为指标评价亚油酸脂质氧化水平。

1.3.7 迷迭香提取物对AAPH诱导DNA氧化损伤的影响

在终浓度为2 mg/mL的hsDNA（pH6.0、0.2 mol/L PBS溶解）中，加入100 μL不同浓度的迷迭香提取物溶液，再加入终浓度为40 mmol/L的AAPH溶液，反应总体积为1 mL，混匀后于37℃恒温水浴12 h。采用南京建成研究所MDA试剂盒测定hsDNA氧化损伤水平，并根据公式（1）计算迷迭香提取物对AAPH诱导MDA生成的抑制率：

式中：A0为空白组（不加诱导剂和迷迭香提取物）的吸光度；A1为诱导组的吸光度；A2为同时加入迷迭香提取物和诱导剂后的吸光度。

1.3.8 统计学分析

所有试验重复3次，结果表示为平均值±标准差。采用SPSS21.0统计软件进行数据处理，最小显著差异法（least significant difference，LSD）进行显著性分析，p<0.05表示差异显著，采用GraphPad Prism 7.0绘图软件进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 迷迭香提取物对Cu2+/H2O2诱导蛋白氧化的影响

迷迭香提取物对Cu2+/H2O2诱导BSA氧化的影响见图1。

图1 迷迭香提取物对Cu2+/H2O2诱导BSA氧化的影响Fig.1 Effect of rosemary extract on oxidative damage of BSA induced by Cu2+/H2O2

由图1A可知，与对照组相比，经Cu2+/H2O2诱导后，试验组BSA条带颜色明显变浅；与模型组相比，随着迷迭香提取物浓度的增加，BSA条带颜色明显变深。由图1B可知，与对照组相比，经Cu2+/H2O2诱导后，试验组BSA条带相对灰度显著降低（p＜0.05）；与模型组相比，BSA条带相对灰度随迷迭香提取物浓度的增加而显著升高（p＜0.05），该结果与张月等[14]研究结果相一致。出现该结果的原因可能是，Cu2+/H2O2能够通过Fenton反应产生羟自由基诱导BSA发生氧化降解，从而造成蛋白条带灰度降低，而迷迭香提取物含有的多酚类物质能够清除羟自由基，从而抑制蛋白氧化降解[15]。

2.2 迷迭香提取物对AAPH诱导蛋白氧化的影响

迷迭香提取物对AAPH诱导BSA氧化的影响见图2。

图2 迷迭香提取物对AAPH诱导BSA氧化的影响Fig.2 Effect of rosemary extract on oxidative damage of BSA induced by AAPH

如图2所示，与对照组相比，AAPH处理组BSA条带颜色变浅，BSA条带相对灰度显著降低（p＜0.05）；与模型组相比，BSA条带相对灰度随提取物浓度的升高而显著升高（p＜0.05），这与Cu2+/H2O2诱导蛋白氧化损伤的结果相一致。以上结果表明，迷迭香提取物能够有效抑制AAPH诱导的BSA氧化降解。

2.3 迷迭香提取物对自由基诱导蛋白羰基化的影响

迷迭香提取物对自由基诱导BSA羰基化的影响见图3。

图3 迷迭香提取物对自由基诱导BSA羰基化的影响Fig.3 Effect of rosemary extract on carbonylation of BSA induced by free radicals

蛋白羰基化是衡量蛋白质氧化损伤的一个重要指标[16]。从图3A可知，对照组BSA中羰基含量很低，为3.80 nmol/mg；经Cu2+/H2O2处理90 min后，BSA羰基含量显著升高至30.09 nmol/mg（p<0.05）。迷迭香提取物能有效抑制Cu2+/H2O2诱导BSA中羰基含量的升高（p<0.05），其抑制作用随提取物添加浓度的升高而增强。由图3B可知，AAPH处理组BSA羰基含量较对照组显著升高（p<0.05）；迷迭香提取物能有效抑制AAPH诱导BSA中羰基含量的升高（p<0.05），其抑制作用随添加浓度的升高而增强，与Cu2+/H2O2诱导下的结果相类似。

迷迭香提取物中含有的迷迭香酸、迷迭香酚、鼠尾草酸和鼠尾草酚等多种多酚类物质[10，17]，能够通过清除Cu2+/H2O2及AAPH反应体系产生的羟自由基、烷氧自由基等抑制BSA羰基化修饰。

2.4 迷迭香提取物对FeSO4诱导亚油酸氧化的抑制作用

迷迭香提取物对FeSO4诱导亚油酸氧化的影响见图4。

图4 迷迭香提取物对FeSO4诱导亚油酸氧化的影响Fig.4 Effect of rosemary extract on LA oxidation induced by FeSO4

LA是一种常见的多不饱和脂肪酸且极易发生脂质氧化[18]。如图4A所示，FeSO4处理组中LA共轭二烯含量为 152.20 μmol/L，显著高于对照组（p<0.05）；迷迭香提取物能够有效抑制FeSO4诱导LA共轭二烯含量的升高（p<0.05），其抑制作用随添加浓度的升高而增强。

MDA是油脂中不饱和脂肪酸氧化分解所产生的次级氧化产物[19]。由图4B可知，对照组LA氧化所产生的MDA含量很低，而在模型组中，FeSO4单独处理后，LA发生脂质氧化，导致其产生的MDA含量显著升高（p＜0.05）；随着处理组中迷迭香提取物浓度的升高，LA氧化所产生的MDA含量逐渐降低。这说明迷迭香提取物能够有效抑制LA氧化，且抑制作用随其浓度的升高而增强。这与姚雯等[20]研究血根碱对FeSO4诱导LA氧化影响的结果相一致。

2.5 迷迭香提取物对AMVN诱导亚油酸氧化的抑制作用

迷迭香提取物对AMVN诱导亚油酸氧化影响见图5。

图5 迷迭香提取物对AMVN诱导亚油酸氧化影响Fig.5 Effect of rosemary extract on LA oxidation induced by AMVN

AMVN在热分解条件下会产生烷氧自由基，从而引发LA脂肪氧化的链式反应，加速油脂氧化。由图5A可知，处理组中较低浓度的迷迭香提取物未能显著抑制共轭二烯产物的生成，而其浓度为100 μg/mL～500 μg/mL 时，LA 脂质氧化显著得到抑制（p＜0.05）；由图5B可知，在AMVN作用下，模型组LA发生脂质氧化，而对照组LA氧化程度较低；从处理组中可以得出，迷迭香提取物可以显著（p＜0.05）抑制MDA的生成，且其抑制效果随提取物浓度（25 μg/mL～500 μg/mL）的升高而逐渐增强。

2.6 迷迭香提取物对AAPH诱导DNA氧化损伤的影响

迷迭香提取物对AAPH诱导DNA氧化损伤的抑制作用见图6。

图6 迷迭香提取物对AAPH诱导DNA氧化损伤的抑制作用Fig.6 Inhibitory effects of rosemary extract on AAPH-initiated DNA oxidative damage

DNA是机体遗传信息的载体，AAPH产生的自由基会攻击DNA，引发DNA氧化损伤，通过测定DNA氧化产物在532 nm处的吸光度可判断其氧化损伤的程度。由图6可知，迷迭香提取物能够有效抑制AAPH诱导hsDNA氧化，其抑制率随添加浓度的升高而显著升高（p＜0.05）。

3 结论

本试验表明迷迭香提取物对不同自由基引发的蛋白质氧化降解、羰基化修饰，脂质氧化和DNA氧化损伤均有显著的抑制作用，且抑制作用随其浓度的升高而增强；出现这一结果的原因可能是迷迭香提取物阻断了Cu2+/H2O2、AAPH、FeSO4和AMVN等诱导剂引发的自由基链式反应从而抑制生物大分子及LA的氧化损伤。该研究为迷迭香提取物预防某些与蛋白氧化损伤有关的疾病及功能性食品的开发提供了一定的理论依据。在今后的试验中应采用动物试验进一步评价迷迭香提取物对自由基诱导蛋白质、油脂及DNA氧化的抑制作用及机制。