不同浓度忧遁草提取物抑制阪崎肠杆菌生长模型的研究

姚昱锟 林其洋 方婷

摘 要：人类感染阪崎肠杆菌（Cronobacter sakazakii）会引起一系列疾病，而忧遁草（Clinacanthus nutans CN）是一种具有消炎抑菌作用的天然药用植物。为了量化评估忧遁草对阪崎肠杆菌的抑制作用，以阪崎肠杆菌为研究对象，探究在阪崎肠杆菌最适生长温度37℃下，不同浓度的忧遁草提取物（25、50、75、100mg/mL）对在BHI中生长的阪崎肠杆菌的影响。结果表明，添加浓度为10%的体系中，忧遁草对延长阪崎肠杆菌的延滞期最长时常为4.116h，阪崎肠杆菌生长速率为1.094，而空白对照组分别为1.253h、1.726。可见，忧遁草对阪崎肠杆菌具有较好的抑制作用，且浓度越高，抑制效果越好。

关键词：忧遁草;阪崎肠杆菌;生长模型

中图分类号 R285文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）15-0028-06

Abstract： Cronobacter sakazakii can cause a series of diseases，and Clinacanthus nutans is a natural medicinal plant with anti-inflammatory and antibacterial effects.In order to quantify and evaluate the inhibitory effect of Cronobacter sakazakii on Clinacanthus nutans， this paper took Cronobacter sakazakii as the research object to explore different concentrations （25，50，75，100mg/mL） of Clinacanthus nutans extract at the optimal growth temperature of 37℃ on Cronobacter sakazakii grown in BHI.The results showed that the longest lag period of Clinacanthus nutans for prolonging Cronobacter sakazakii was 4.116 h in a system with a concentration of 10%，and the growth rate of Cronobacter sakazakii was 1.094， while the data of blank control group were 1.253h and 1.726， respectively.The results illustrated that Clinacanthus nutans had an excellent inhibitory effect on Cronobacter sakazakii， and the higher the concentration， the better the inhibitory effect.

Key words： Clinacanthus nutans; Cronobacter sakazakii; Growth model

阪崎肠杆菌（Cronobacter sakazakii）属于肠杆菌科肠杆菌属，兼性厌氧革兰氏阴性菌，主要寄生于人和动物的肠道内，导致诸如新生儿脑膜炎、菌血症、坏死性结肠炎[1-2]等一系列疾病。目前，乳饮料[3]、奶酪[4]和纯牛奶[5]是阪崎肠杆菌的主要检出对象，虽然医学上可以通过抗生素治疗相关疾病，但抗生素的频繁使用会导致该菌对抗生素耐药性的提高以及其他不良反应和副作用[6]。近年来，对阪崎肠杆菌的研究主要包括耐热性[7]、耐酸碱性[8]以及水分活度、pH、培养基成分等因素的影响。鉴于阪崎肠杆菌的危害，找到对其有抑制作用的植物天然化学物质具有重大意义。

忧遁草（Clinacanthus nutans）为爵床科（Acanthaceae）鳄嘴花属植物，别名鳄嘴花、扭序花、青箭、沙巴蛇草、柔刺草、小接骨等[9]，广泛分布于马来西亚、泰国、越南、印度尼西亚以及我国南部至西南部等热带地区[10]，是一种比较著名且广泛使用的药用植物。当前，世界各地对忧遁草的研究主要集中于忧遁草的抗病毒、抑制炎症、抗癌、抗氧化以及成分等方面。国内有研究表明，产自揭阳的忧遁草提取物的抗氧化能力优于产自海南的忧遁草提取物[11]。

為了探知微生物的生长状态与外界环境变化之间的关联，建立一定的数据模型对微生物的生长情况进行比较，是目前比较流行的微生物数据处理模式。目前，大部分的微生物试验都与病原菌相关，因此，采用合适的微生物预测模型，有利于试验结果的评估[12]。

本研究开展了不同浓度的忧遁草提取物对阪崎肠杆菌的抑制作用试验，通过软件IPMP2013建立阪崎肠杆菌在不同条件下动力学模型，使用模型评价忧遁草对阪崎肠杆菌抑制作用的量效关系。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 原料与菌种 揭阳忧遁草，购于揭阳许氏忧遁草种植基地。阪崎肠杆菌（ATCC 21544），购于中国检验检疫科学研究院食品安全研究所。

1.1.2 培养基及主要试剂 详见表1。

1.1.3 主要试剂的配置方法 脑-心浸萃液态培养基（BHI）：按说明书指示称取BHI37g溶于1L的蒸馏水或去离子水中，使用微波炉加热煮沸并搅拌至完全溶解，在高压灭菌锅中于121℃灭菌15min;结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）培养基：按说明书指示称取VRBGA51.5g溶解于1L的蒸馏水中，使用微波炉煮沸但沸腾时间不需要超过2min，待冷却至50℃左右倒平板;1‰蛋白胨水（PW）：称取1g的蛋白胨溶于1L的蒸馏水中，分别以9mL和9.9mL分装于试管中，于高压灭菌锅中121℃灭菌15min备用;25mg/mL忧遁草提取液：称取0.375g的忧遁草提取物溶解于脑-心浸萃液态培养基（BHI），补足至15mL;50mg/mL忧遁草提取液：称取0.75g的忧遁草提取物溶解于脑-心浸萃液态培养基（BHI），补足至15mL;75mg/mL忧遁草提取液：称取1.125g的忧遁草提取物溶解于脑-心浸萃液态培养基（BHI），补足至15mL;100mg/mL忧遁草提取液：称取1.5g的忧遁草提取物溶解于脑-心浸萃液态培养基（BHI），补足至15mL。

1.1.4 仪器与设备 详见表2。

1.2 试验方法

1.2.1 阪崎肠杆菌培养 装有阪崎肠杆菌冻干粉的塑料瓶→75%酒精棉消毒→封口处用酒精灯火焰烧热→立即滴无菌水于塑料瓶封口处→旋开塑料瓶盖子→加入1mL的BHI脑-心浸萃液态培养→溶解阪崎肠杆菌冻干粉→吸出并转移至盛有10mL灭菌过的BHI培养管中→37℃静置培养24h→吸取0.1mL菌悬液移至盛有10mLBHI的试管中，37℃恒温培养箱振荡培养24h→吸取0.1mL菌悬液加入到盛有10mLBHI的试管中，37℃恒温培养箱振荡培养24h→得到菌悬液[13-14]。

1.2.2 菌种保藏 将0.5mL菌悬液加入1.5mL的无菌塑料管→加入0.5mL纯甘油→盖紧管盖置于-80℃冰箱中保藏。用无菌接菌环挑取一环菌悬液置于VRBGA平板培养基的表面划线培养，将其置于37℃恒温培养箱中培养24h，其后将平板置于4℃的冰箱中保存，该方法可以使菌体保持活力约1个月。

1.2.3 菌悬液制备 在进行实验前12h，使用无菌接菌环挑取结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂培养基上的1株阪崎肠杆菌转移至装有10mL脑-心浸萃液态培养基的无菌离心管中，置于37℃的恒温振荡箱中培养12h，130转，使阪崎肠杆菌恢复生长，之后菌悬液经过离心机离心（2500r，15min），在无菌条件下倒去上清液，加入10mL的蛋白胨水，充分溶解后再将其离心10min，再用10mL的蛋白胨水溶解沉淀，将菌悬液在装有蛋白胨水的试管中进行梯度稀释，稀释成约为102～103CFU/mL的菌悬液。

1.2.4 不同浓度忧遁草对阪崎肠杆菌生长的影响试验 在无菌操作台中往50mL离心管中分别加入（0.375g、0.75g、1.125g和1.5g）不同品种的忧遁草提取物，然后加入BHI培养基，补足至15mL，以不添加忧遁草提取液脑-心浸萃液态培养基组作为对照，37℃下培养24h（每个样品做两个平行），在不同的时间点取出菌液，用1‰的无菌蛋白胨水稀释至合适的梯度，然后使用涂平板计数法计算菌落数。

1.2.5 曲线拟合与模型的建立 应用美国农业部东部研究中心开发的IPMP 2013软件对试验所得数据进行分析并建立模型。用Huang模型、Baranyi模型和Gompertz型，拟合含有不同浓度的忧遁草提取物的BHI中阪崎肠杆菌的生长数据，建立不同条件下阪崎肠杆菌生长的一级动力学模型。通过比较几种模型的拟合参数，确定不同条件下阪崎肠杆菌在含有不同浓度的忧遁草提取液的BHI中生长的最佳模型。

2 结果与分析

2.1 37℃下BHI中阪崎肠杆菌生长曲线 由图1可知，阪崎肠杆菌的接入量为102～103CFU/mL，在生长曲线的实验中，这是合适的接入浓度。拟合模型的参数AIC和RMSE越小，则代表该数据模型的拟合效果越好。Y0代表初始接菌量，Lag代表延滞期，Ymax则代表稳定期时的菌落数量，μmax则代表是最大比生长速率，结合各项参数得知，Huang模型为该条件下的最佳拟合模型（见表3）。

2.2 不同浓度揭阳忧遁草提取物BHI中的阪崎肠杆菌生长曲线

2.2.1 37℃下揭阳忧遁草提取物浓度为2.5%BHI中阪崎肠杆菌的生长曲线 从拟合曲线和拟合参数可以看出，Huang模型和Baranyi模型拟合效果优于Gompertz模型，Huang模型的各项参数略低于Baranyi模型的拟合参数，结合拟合模型效果可以得知，Huang模型更适合拟合37℃下揭阳忧遁草提取物添加浓度为2.5%的BHI中阪崎肠杆菌的一级模型（见图2、表4）。该试验组的最大比生长速率为1.501，延滞期为1.886。

2.2.2 37℃下揭阳忧遁草提取物浓度为5%BHI中阪崎肠杆菌的生长曲线 从拟合曲线可以看出，Huang模型和Baranyi模型拟合效果优于Gompertz 模型，Huang模型的AIC和RMSE均低于Baranyi模型，结合拟合模型其他参数，可以得知，Huang模型更适合拟合37℃下揭阳忧遁草提取物浓度为5%的BHI中阪崎肠杆菌的一级模型（见图3、表5）。该实验组的最大比生长速率为1.385，延滞期为2.236h。

2.2.3 37℃下揭陽忧遁草提取物浓度为7.5%BHI中阪崎肠杆菌的生长曲线 从拟合曲线可以看出，Huang模型和Baranyi模型的拟合效果较好，Huang模型的AIC和RMSE均低于Baranyi模型，结合拟合模型其他参数，可以得知Huang模型更适合拟合该条件下BHI中阪崎肠杆菌的一级模型（见图4、表6）。实验组的最大比生长速率为1.224，延滞期为3.4h。

2.2.4 37℃下揭阳忧遁草提取物浓度为10%BHI中阪崎肠杆菌的生长曲线 从拟合曲线可以看出，Huang模型和Baranyi模型拟合效果较好，Huang模型的AIC和RMSE略低于Baranyi模型，结合拟合模型其他参数，可以得知Huang模型更适合拟合该条件下BHI中阪崎肠杆菌的一级模型（见图5、表7）。实验组的最大比生长速率为1.094，延滞期为4.116h。

2.3 不同浓度忧遁草对阪崎肠杆菌抑制作用的影响 使用软件IPMP 2013的不同拟合模型分别对含有不同浓度忧遁草提取物的BHI中阪崎肠杆菌的生长情况进行拟合，并根据AIC值与RMSE值2个参数以及模型的拟合程度选择最适模型，AIC值与RMSE值越小，表明该种模型拟合效果最佳，则应选取该模型下的参数描述阪崎肠杆菌的生长状况。由表4、表5、表6及表7可知，在所有的拟合结果中，Huang模型和Baranyi模型的拟合结果较好，Gompertz模型拟合结果较差，Huang模型的拟合参数均略小于Baranyi模型，所以选取Huang模型的拟合参数延滞期与最大比生长速率作为评价指标进一步的评价忧遁草提取物对阪崎肠杆菌的抑制作用，由于在10h时BHI中的阪崎肠杆菌已经进入稳定期，而添加忧遁草提取物的BHI中阪崎肠杆菌没有进入稳定期，因此选取该时间点下BHI中崎肠杆菌菌落数作为一个评价指标。

2.3.1 延滞期 从图6可以看出，阪崎肠杆菌的延滞期在揭阳忧遁草提取物的作用下相比于对照组显著延长，并且与忧遁草提取物的添加剂量呈正相关的关系。在添加了揭阳忧遁草提取物的试验组中，延滞期从长到短为：4.116、3.4、2.236和1.886h，对应的体系中提取物的浓度为10%、7.5%、5%、2.5%。在空白对照中，阪崎肠杆菌的延滞期仅为1.253h，表明产自揭阳的忧遁草提取物具有延长阪崎肠杆菌延滞期的作用。

2.3.2 最大比生长速率 如图7所示，忧遁草在任何浓度下都能够降低阪崎肠杆菌的生长速率，其最大比生长速率的大小与培养液中的忧遁草提取物浓度呈反比。添加忧遁草提取物试验组的最大比生长速率从大到小的顺序为1.501、1.385、1.224、1.094。空白对照组中阪崎肠杆菌的最大比生长速率为1.728。对比可以得出，忧遁草提取物对阪崎肠杆菌具有抑制效果，能降低体系中阪崎肠杆菌的最大比生长速率。

2.3.3 10h时体系中的菌落总数 当微生物进入稳定期后，体系中微生物的数量将不再增长。在10h时，空白对照组中的阪崎肠杆菌已经进入了稳定期，但添加了不同浓度忧遁草试验组中的阪崎肠杆菌却尚未进入稳定期。由图8可知，不同浓度的忧遁草提取物对阪崎肠杆菌的抑制效果不同，抑制效果与浓度呈正相关。结果表明，揭阳忧遁草可以延长阪崎肠杆菌的延滞期，也可以降低阪崎肠杆菌的最大比生长速率，效果与忧遁草提取物浓度成正比。这可能是由于忧遁草浓度越高，忧遁草中的植物化学物质含量越高，导致其对阪崎肠杆菌的抑制效果越好。将阪崎肠杆菌培养10h后，BHI中的阪崎肠杆菌已进入稳定期，但添加忧遁草提取物的试验组中尚未进入，虽然两者之间差异并不显著，但均能够有效地降低体系中的菌落數量。

3 结论

由本研究结果可知：（1）在试验浓度梯度下，揭阳忧遁草对延长阪崎肠杆菌的延滞期最长时常为4.116h，对应的体系中提取物的浓度为10%，对照组则为1.253h。（2）揭阳忧遁草能有效降低阪崎肠杆菌的最大比生长速率，在添加浓度为10%的体系中，阪崎肠杆菌的生长速率为1.094，空白组的最大比生长速率则为1.726。

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（责编：张宏民）