光遗传学技术在睡眠-觉醒相关神经核团及环路研究中的应用综述

孙 华，郭永馨，张文娟，仝 黎

解放军总医院第一医学中心 麻醉手术中心，北京 100853

睡眠是高等脊椎动物普遍的生理机制，并且是维持人体特别是大脑功能所必需的一种行为。在日常生活中睡眠不足会导致疲惫、记忆力和注意力下降。在动物实验中，长时间的睡眠剥夺最终会诱发动物免疫力下降、运动能力下降、体温调节机制紊乱、下丘脑功能严重紊乱，甚至导致多器官功能不全而死亡[1]。睡眠紊乱的相关疾病也是困扰患者的棘手问题。因此有许多神经科学研究步入睡眠与觉醒调节机制的领域，开展了许多关于睡眠-觉醒神经核团及环路研究。在这些研究中，应用了多种神经生物学以及细胞生物学方法，如电生理、荧光标记、钙成像技术、免疫组化技术、手术切除相应核团以及应用各种神经递质受体的激动剂和拮抗剂等。在众多方法中，光遗传学技术近年来脱颖而出。2005 年Deisseroth 的实验室第一次把视紫红质通道蛋白2(ChR2)表达于离体哺乳动物海马神经细胞中，控制其电活动以及神经递质释放[2]。之后光遗传学技术飞速发展，结合了基因工程技术和前沿的光学技术在动物实验中广泛应用。由于其可在特定时间、特定细胞精确性表达而成为时下生命科学以及神经科学研究的有力工具。本文就光遗传学技术应用于睡眠-觉醒神经核团及环路研究的成果进行综述。

1 光遗传学技术在睡眠觉醒核团研究中的应用

光遗传学技术对脑区睡眠觉醒的核团进行光刺激，需要在特异性的细胞中找到合适的光遗传蛋白表达，根据实验目的进行蛋白工具的选择，兴奋性的视蛋白主要有ChR2，抑制性的视蛋白主要有NpHR(嗜盐菌紫质)和Arch(苏打红盐菌的视蛋白)等[3-4]。视蛋白需与某一种荧光蛋白如黄色荧光蛋白(YFP)、增强型绿色荧光蛋白(GFP)和增强型红色荧光蛋白(mCherry)等同时表达，以检验其是否正常表达同时便于观察神经元和神经环路的具体位置。这些已经选定的视蛋白和荧光蛋白结合的基因片段需要通过特殊的病毒载体转染于目标神经细胞。载体包括腺相关病毒、慢病毒等。为了特异性表达，同时还需要基因工程技术将含有Cre 酶的基因片段表达于相关特异性细胞中，如胆碱能神经元、GABA 能神经元、Orexin 能神经元等调节睡眠觉醒的神经元中。最近的一项动物研究发现，一种犬腺病毒2 载体可以注射于小鼠脑内神经元轴突末端的区域，经过长距离的逆行性转导，使所有神经元胞体表达视蛋白[5]。在上述工作完成后就需要在相应部位置入光纤导管，根据视蛋白种类选择不同波长的光来刺激动物的特定区域，实现神经元的快速兴奋或抑制，而光刺激模式的选择则需要结合不同的神经元类型在实验中摸索。有研究者也发明了无线光遗传学技术，将胡椒大小的电子器件置入小鼠大脑，无线光刺激后对小鼠的运动产生影响，可以减少对小鼠正常活动的干扰[6]。这一技术可以对小鼠睡眠环境产生更小的影响，与光纤导管相比有着独特的优势。

2 利用光遗传学技术研究下丘脑的神经核团

下丘脑是调节内脏活动和内分泌活动的较高级神经中枢，调节体温、摄食、睡眠、水盐平衡和内分泌腺活动等重要的生理功能。在以往研究中睡眠觉醒调节核团主要位于腹外侧视交叉前区(ventrolateral preoptic area，VLPO)、 下 丘 脑 外 侧区黑色素聚集激素神经元(melanin-concentrating hormone，MCH)、下丘脑外侧区食欲肽(Orexin)神经元和结节乳头核(tuberomammillary nucleus，TMN)中[7]。这些核团相互影响，共同参与了睡眠觉醒的调节。

20 世纪末研究者们发现了食欲肽(Orexin)及其受体在调节神经活性和调节摄食行为方面的作用[8]。之后在动物在体实验中又有研究发现这种神经元及受体还参与了睡眠与觉醒的转换，并运用基因敲除技术敲除Orexin 基因研究其对睡眠状态的影响[9-10]。在这些理论的基础上，Ferrari 等[11]将携带有编码VGAT 启动子和ChR2 的慢病毒注射在转基因小鼠的下丘脑外侧区，采用光遗传学技术调控投射在该区域的Orexin 能神经元的GABA能神经元轴突末梢，从而调控动物在睡眠到觉醒状态的转换。另有研究者采用小鼠动物模型利用光遗传学技术激活中缝背核(dorsal raphe nucleus，DRN)区五羟色胺能(5-HT)神经元，记录Orexin 能神经元的突触后反应，结果显示5-HT 神经元可能通过5HT1A 受体直接抑制Orexin 能神经元，也可能通过调控GABA 能神经元间接抑制Orexin 能神经元，进而调节动物的清醒状态以及睡眠状态[12]。此外也有在体研究用光遗传刺激该核团，来研究其与应激焦虑相关的行为学表现，同时也引起了睡眠向觉醒的改变[13]。总之，Orexin 能神经元因其在脑内投射广泛，在未来的神经环路研究中仍有着重要的意义。

下丘脑外侧区MCH 神经元与Orexin 能神经元在脑内投射区域基本相似，与Orexin 能神经元在睡眠觉醒调节中有着互补的作用。在体动物实验中用光遗传学方法刺激MCH 神经元可增加非快速动眼睡眠期(non-rapid eye movement sleep，NREM)及快速动眼睡眠期(rapid eye movement sleep，REM)的睡眠时间[14]。2016 年有研究结果显示，在大鼠下丘脑注射携带ChR2 的病毒，利用光遗传学技术分别采用5 Hz、10 Hz 和30 Hz 的蓝光特异性激活MCH 神经元，可增加夜晚REM 期及NREM 期的睡眠时间，白昼期间仅REM 期睡眠增加[14]。也有在体研究指出在光刺激MCH 后NREM 期增加并且脑电图分析出现稳定的慢波Delta 波，以上两种研究的不同结果可能是与刺激的频率方式以及刺激部位不同导致的。MCH 神经元既可促进NREM 向REM 期的转换，同时也对NREM 期睡眠的产生和维持发挥作用[15]。

MCH 神经元被认为是一种GABA 能神经元，释放GABA 抑制下游神经元，最近有研究证实用光遗传学刺激中隔核外侧区(lateral septal nucleus，LS)的MCH 神经元轴突末端，通过电生理指标发现MCH 神经元向LS 区投射释放谷氨酸使LS 激活，而谷氨酸同时激活了其他部位的GABA 能神经元，这些GABA 能神经元也投射到LS 区并形成了的前馈抑制机制[16]。之前研究发现只有在睡眠期才可以观察到MCH 神经元的活动，最近有证据表明它在觉醒期也有神经活动[17]。上述发现证明MCH 神经元不只是一种GABA 能神经元而且还释放谷氨酸影响下游神经元，可能参与觉醒期的调节，未来也可以研究MCH 神经元与Orexin 之间是否存在协同作用，并寻找在觉醒期调节方面的相关环路。 结节乳头核是中枢神经系统中组胺的唯一来源，虽然已经知道腹外侧视交叉前区是主要的睡眠激活中心[18]，也知道组胺能神经元在觉醒中的作用[19]，但仍然不知道哪些神经环路参与其中。Williams 等[20]将光遗传学技术与电生理技术结合来探究TMN 区组胺能神经元与VLPO 区GABA 能神经元在促进觉醒功能中的神经环路，用组氨酸脱羧酶-Cre 小鼠结合ChR2-mCherry 表达在结节乳头核腹外侧区(vlTMN)的组胺能神经元，在光刺激相应区域后可以用电生理技术记录vlTMN 神经元和VLPO 神经元中的自发抑制性突触后电流(sIPSC)，发现从TMN 区释放的组胺通过H3 受体可以减少GABA 能神经元向vlTMN 神经元的传入从而对自身进行去抑制，并且组胺能神经元可以通过H1 受体激活GABA 中间神经元从而抑制VLPO 区GABA 能神经元对vlTMN 区的抑制，以激活TMN 区神经细胞。VLPO 区神经元和TMN 区神经元彼此相互抑制，激活一个相应的会抑制另外一个的表达。这一结果验证了之前研究中睡眠与觉醒调节的“触发开关”假说，使睡眠或觉醒状态转换迅速[9]。Neuron 的一篇小鼠在体光遗传学研究显示，组胺能神经元以旁分泌形式释放GABA来参与睡眠调节，敲除转基因小鼠组胺能神经元中的VGAT 基因(编码GABA 转运体)可导致觉醒期额外增加[21]。这样的自身调节机制可能是为了使睡眠觉醒趋于一个稳定的状态，防止组胺能神经过度激活，导致睡眠觉醒调节神经网络紊乱。也许其他神经元中也有类似的机制，使大脑中神经环路调节稳定。

3 用光遗传学技术研究丘脑网状核与丘脑皮质环路

丘脑网状核(thalamic reticular nucleus，TRN)是位于丘脑与皮质之间的GABA 能抑制性神经核团，参与感觉的加工、注意力控制、睡眠觉醒的调节[22]。睡眠梭形波产生于丘脑皮质环路中，是在NREM 睡眠期观察到的特征性脑电图节律，频率为7 ～ 15 Hz。用光遗传学方法刺激转基因(VGAT-ChR2)小鼠TRN 神经元，同时记录皮质脑电图，发现刺激频率不同形成的脑电图波形也不同，最终确定了最有效的激发皮质睡眠梭形波的光刺激模式，产生在结构与功能上与自发睡眠梭形波相似的波形，这些波形延长了NREM 期睡眠时间，并且波形密度与睡眠时间相关[23]。这进一步证实了丘脑是感觉信息中继站，睡眠梭形波可能通过阻止外界感觉信息传入来增加睡眠稳定性以此维持睡眠。由此可以看出，丘脑皮质神经环路是睡眠调节网络的重要部分。Lewis 等[24]用光遗传学技术刺激TRN 区可在脑电图中检测到慢波，并减少了觉醒状态的持续时间，可以对皮质的状态进行快速调节。也有在体动物光遗传学研究表明LH-GABA 神经元投射抑制性信号控制TRNGABA 神经元形成前馈抑制的环路，用光遗传刺激该神经环路中LH-GABA 神经元可在NREM 期抑制TRN 神经元活性从而引起觉醒，在REM 期则没有显著变化，同时也可以引起深度麻醉中的觉醒。而用光遗传蛋白Arch 抑制该环路则可以增加小鼠NREM 睡眠持续时间，使NREM 期睡眠稳定，脑电图分析显示Delta 波增多。在立体定位仪下注射有CHETA-EYFP 片段的腺相关病毒，结合病毒示踪技术发现了LH-GABA 与TRN 前后区域都有单突触联系。用Arch 蛋白抑制TRN 细胞也可引起NREM 期觉醒[25]。以往的研究指出胆碱能神经元与REM 期产生有关，参与促觉醒作用。但最新研究显示应用光遗传学技术刺激传入TRN 的胆碱能神经元会激活GABA 能神经元而引起睡眠[26]。继续深入研究TRN 区与其他核团的联系仍需借助光遗传学手段。

丘脑室旁核(thalamic paraventricular nucleus，PVT)也成为近年来研究的热点，利用光遗传学技术可发现丘脑室旁核中谷氨酸能神经元促进了睡眠向觉醒的转换，而这一促觉醒作用可能与下丘脑外侧区中Orexin 能神经元向该区域的投射相关[27]。

4 用光遗传学技术研究中脑腹侧背盖区神经核团

之前对于中脑腹侧背盖区(ventral tegmental area，VTA)的研究主要集中于机体的奖赏机制、成瘾现象以及恐惧记忆的形成[28-30]。近些年VTA核团参与睡眠机制的调节逐渐受到关注。一项发表于PNAS 的研究结果证实，通过光遗传学特异性激活VTA 核团多巴胺神经元能够促进动物从麻醉状态向觉醒状态转换，首次为VTA 核团多巴胺神经元参与全麻药物诱导的麻醉效应向觉醒过程转换的作用机制提供了证据[31]。有研究报道利用光遗传技术特异性激活小鼠VTA 区的谷氨酸能神经元可以使觉醒期和REM 期延长，产生促进觉醒的作用；相反激活VTA 区GABA 能神经元则能维持长时间的NREM 睡眠期，如果将这些神经元损毁则能增加清醒期长达4 个月[32]。VTA 核团的神经元种类复杂，可能通过投射到下游的伏隔核(nucleus accumbens，NAc)或下丘脑发挥调解睡眠的作用。

5 结语

光遗传学技术已经广泛应用于调节睡眠觉醒的神经核团和环路研究中。光遗传方法与传统的电刺激方法相比，一个主要的优点就在于它可以对动物进行最小的干预、在特定的时间窗来激活神经细胞活性，也可以减少睡眠状态转换的潜伏期并减小实验结果的变异性，在科学性上更具有说服力。在具体应用时，也需要结合上述方法和其他生命、神经科学领域前沿的多种方法如脑功能性MRI、化学遗传学方法综合应用以达到实验目的。未来需要继续开发创新光遗传学技术以更加深入地研究睡眠觉醒的调节机制，帮助人类攻克失眠、嗜睡等临床问题，并对全身麻醉的机制进行更深入的研究。