微重力调控骨重建的细胞和分子机制研究进展

王艺璇，王 可，张 舒

空军军医大学 航空航天生物动力学教研室，航空航天医学教育部重点实验室，陕西西安 710032

骨骼是一个极其特殊和充满活力的器官，骨重建存在于人的一生，是正常成人骨代谢的主要方式，对骨内环境保持稳定至关重要。骨重建是修复因日常体力负荷而造成的陈旧性骨损伤，预防衰老效应及其后果的重要手段。骨重建包括骨吸收及骨形成两个阶段，这两个阶段的平衡对于维持骨量和全身矿物质稳态至关重要。骨重建过程中骨吸收增加、骨形成减少，常引发骨质丢失，甚至造成骨质疏松[1]。微重力导致的骨质丢失是限制中长期载人航天任务和火星探险活动的最主要因素之一。航天员长时间停留于太空中，微重力环境中骨骼受到的力学刺激减少，打破了骨重建过程中骨吸收与骨形成之间的平衡，导致骨量以平均每个月1% ～ 2%的速率丢失。目前的药物治疗、体育锻炼尚不能有效阻止骨质的持续丢失[2]。航天飞行及地面模拟微重力实验(如人体卧床实验、动物尾吊模型及细胞回转等)均可用于研究机械刺激对骨重建的影响。本文就近年来关于微重力影响骨重建的细胞和分子机制研究进行综述。

1 骨重建概述

生理性骨重建是一个高度协调的过程，是多种骨组织细胞(包括破骨细胞、成骨细胞、骨细胞和免疫细胞等)共同作用下旧骨吸收、新骨形成的骨组织自我更新，是修复受损骨和维持矿物质稳态所必需的过程。骨重建发生在数周内，由排列在被称为“基本多细胞单元”(basic multicellular unit，BMU)的临时解剖结构内的破骨细胞和成骨细胞等动态耦联完成。每一个完整的BMU 都由骨内衬细胞包裹形成骨重建室，前方由一组破骨细胞溶解吸收骨组织，而成骨细胞跟随其后，不断分泌和沉积未矿化的胶原成骨以填充骨吸收后留下的空间。BMU 内细胞这种独特的空间和时间排列，为耦合的骨吸收-骨形成创造了一个独特的微环境，保证了骨重建五个连续阶段—激活、吸收、逆转、形成和终止的协调[3-4]。

激活期是骨重建的第一阶段。骨骼在此之前处于静止状态，检测到初始的重塑信号，如机械刺激或激素水平改变(如雌激素或甲状旁腺激素)[5-6]。对骨骼造成机械应变或微损伤的力学信号可以被转换为能够由骨细胞感知的生物信号[6-7]。破骨前体细胞随之被招募到需要骨重建的部位，启动骨重建。骨吸收期主要由破骨细胞所介导，成熟的破骨细胞形成后可产生αVβ3整合素分子，分泌组织蛋白酶K 等溶酶体酶消化有机骨基质，同时骨组织局部微环境中pH 值降低，无机矿物质溶解，形成骨吸收陷窝[8]。骨吸收后，空腔中含有多种细胞，包括单核细胞和骨细胞等。骨陷窝由富含糖蛋白和酸性磷酸成分的黏性物质沉积填平，但缺乏胶原成分的沉积。然而逆转期中骨吸收结束和骨形成开始的耦合信号尚不十分清楚。目前研究发现，转化生长因子-β 含量与骨转换率有关，其可抑制成骨细胞产生NF-κB 受体激活蛋白配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)， 从而减少破骨细胞的吸收[9]。之后破骨细胞逐渐被成骨细胞所取代，进入由成骨细胞介导的骨形成期。成骨细胞合成分泌Ⅰ型胶原蛋白(type Ⅰcollagen，Col Ⅰ)等有机成分，产生大量的骨质特异性碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)，细胞外基质逐渐成熟[10]。随着新骨基质矿化，羟基磷灰石晶体被整合到新沉积的类骨中以进行骨质矿化。成骨细胞一部分继续形成新骨，直到它们转化为完全覆盖新形成骨表面的静止骨衬里细胞；另一些成骨细胞则被埋入新形成的骨基质中，成为骨细胞，其广泛的小管网络将其与骨表面衬里细胞、成骨细胞和其他骨细胞连接起来。单个骨重建单位完成上述阶段的改建过程后，暂时进入终止期，直到下一波骨重建开始。

2 微重力对骨组织细胞的影响

2.1 微重力对破骨细胞的影响 破骨细胞是大的多核巨细胞，来源于骨髓造血干细胞，由单核-巨噬细胞系的单核前体细胞分化而来，是目前唯一已知的能够吸收骨的细胞。骨髓基质细胞和成骨细胞所分泌的巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、RANKL 和骨保护素等细胞因子，对破骨细胞前体在体外和体内的存活、增殖和分化至关重要[11]。破骨细胞功能增强在微重力导致的骨质丢失中起着十分重要的作用[12]。航天飞行研究发现，微重力可增强破骨细胞骨吸收陷窝的形成，骨载玻片的总吸收面积同样显著增大[13]。欧洲航天局福田M3 航天飞行任务研究发现，与地面对照组相比，微重力环境中破骨细胞成熟和活性相关的基因表达增加，骨吸收能力增强[14]。国际空间站研究同样证实，微重力可激活破骨细胞[15]。SD 大鼠尾吊4 周后，血清中骨碱性磷酸酶与耐酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)升高，提示骨吸收能力增强[16]。Saxena 等[17]发现小鼠尾吊后肢去负荷28 d 后，其骨髓巨噬细胞在RANKL 和M-CSF诱导刺激后产生的TRAP 阳性多核破骨细胞数量增加。旋转细胞培养系统虽不能诱导RAW 264.7 破骨前体细胞生成，但破骨细胞生成相关的信号分子发生活化，TRAP 阳性多核破骨细胞增多，破骨细胞标记基因TRAP 和组织蛋白酶K 表达增加[17]。Sambandam 等[18]研究发现小鼠RAW 264.7 细胞在使用旋转细胞培养系统培养后破骨分化相关的转录因子如c-Jun 氨基末端激酶和环磷腺苷效应元件结合蛋白表达上调，细胞质中钙离子水平及钙振荡增加。使用旋转细胞培养系统模拟微重力培养小鼠骨髓后，自噬标志物Atg5 和LC3-Ⅱ的表达以及自噬体的形成显著增加，破骨细胞生成增多[19]。此外利用随机定位仪模拟微重力培养FLG 29.1 人前破骨细胞发现细胞骨架改变、凋亡增加，而存活的RANK 及其配体RANKL 表达增加、破骨细胞分化增强[20]。

2.2 微重力对成骨细胞、骨髓间充质干细胞的影响 成骨细胞属于成纤维样细胞，由间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化而成，是一类特殊的具有成骨潜能的细胞，其分化过程以成骨细胞特异基因的顺序激活为标志。成骨细胞分化受到runt 相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)和锌指结构转录因子(Osterix)的调节，其分化早期即开始合成分泌成骨基质主要成分Col Ⅰ和调节骨基质成熟稳定的ALP，而晚期则分泌合成在骨基质矿化成熟中起重要作用的骨钙素[21-22]。骨形态发生蛋白、甲状旁腺激素、Wnt信号通路等蛋白质、激素和信号通路在调节成骨细胞分化等功能方面同样发挥重要作用[23-24]。微重力环境中成骨细胞功能会受到抑制[12]。航天飞行时人体血清中骨形成标志物—骨碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原前肽降低，提示骨形成减少[25]。暴露在航天微重力环境5 d 后，成骨细胞局灶性黏附完整性降低，肌动蛋白和应力纤维减少，呈现扩散的细胞形态[13]。欧洲航天局SpaceX Dragon 航天飞行任务研究发现，成骨细胞暴露在微重力环境14 d 后成骨分化关键因子Runx2、Osterix 和Col ⅠmRNA表达降低[26]。利用放射性DNA 合成标志物研究大鼠尾吊后肢去负荷4 周后股骨中的成骨细胞，发现成骨细胞分化及向骨细胞的转化均明显延缓[27]。多项研究表明微重力环境中，成骨细胞的细胞周期和细胞分化过程均会受到负面影响，具有成骨功能的细胞数量明显减少[28]。研究表明，成骨细胞分化各阶段中的多个转录因子及标志蛋白，如Runx2、Osterix、Col Ⅰ的表达在模拟微重力环境中均明显降低[29]。Wnt/β-catenin 信号通路在成骨细胞中发挥着重要的作用，微重力环境下成骨细胞Wnt/β-catenin 信号通路的激活受到抑制，进一步影响了成骨细胞的增殖与分化功能[30]。非编码RNA 同样可以参与骨形成的各个阶段，微重力环 境 下 众 多microRNAs， 如miR-214、miR-33、miR-139 等，可以通过其各自的靶基因调控成骨细胞的功能[29,31-32]。此外，长链非编码RNA，如lncRNA ODSM、OGRU 在微重力环境中也可通过结合不同的miRNAs 调控成骨分化[33-34]。

骨髓间充质干细胞是一类可自我更新，具有多向分化潜能的干细胞，可分化为成骨细胞、成脂细胞和成软骨细胞等。如果在骨重建过程中这种分化不平衡，脂肪细胞数量增加，成骨细胞数量减少，可能会导致骨量减少甚至骨质疏松[35]。利用SJ-10 返回式科学卫星的实际微重力环境，研究空间微重力对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，发现人骨髓间充质干细胞微重力环境中成骨特异性基因表达减少，而成脂特异性基因表达增加[36]。Pan 等[37]研究发现大鼠尾吊后肢去负荷28 d 后，尾吊大鼠后肢股骨的骨髓间充质干细胞分离培养后成骨标记细胞基因Runx2 表达减少，成骨潜能降低。模拟微重力可降低MSCs 中Runx2、ALP、Col Ⅰ等成骨分化标志基因的表达[38]。微重力环境中MAPK、Notch、PPARγ 等信号通路的激活可能是抑制MSCs 向成骨细胞分化的主要分子机制[39-40]。

2.3 微重力对骨细胞的影响 骨细胞是成骨细胞中无法增殖的终端分化细胞，占骨骼中所有细胞的90% ～ 95%，是成熟骨中最常见的细胞。成骨细胞在骨形成过程中经历了终末分化，被埋入骨基质中成为类骨样骨细胞，形成长的树突状骨细胞突起，呈星形树突状突起延伸至骨基质中的小管，与骨基质中的其他骨细胞或骨表面的成骨细胞相互作用，从而形成腔隙-小管网络。在骨重建过程中骨细胞可感知机械及代谢信号，并能通过合成一氧化氮和硬化蛋白等调节成骨细胞功能[6-7]。微重力导致的骨细胞功能的改变，可能是微重力影响骨重建的是始动因素。Aguirre 等[41]研究发现，尾吊后肢去负荷小鼠骨小梁和皮质骨中的骨细胞凋亡率增加，且凋亡的骨细胞主要分布在骨内膜的皮质骨部位，即骨吸收发生的部位，提示骨细胞的凋亡可能是启动破骨细胞进行骨吸收的重要刺激。此外，模拟微重力可导致骨细胞(MLOY-4)中连接蛋白Wnt 通路下游靶基因Cycling D1 的mRNA 和蛋白表达减少，Connexin43 生物功能被破坏，β-catenin 蛋白表达减少，均提示Wnt/β-catenin 信号通路活性明显下降[42]。同时模拟微重力可使MLOY-4 小鼠骨细胞膜骨架spectrin 以及内质网膜上蛋白IP3R 位置分布发生变化，导致骨细胞钙池操纵Ca2+通道(SOC 通道)活性降低[43]。

3 结语

微重力会影响骨重建的各个阶段，促进骨吸收、抑制骨形成，造成机体骨质丢失。进一步研究阐明微重力影响骨重建的细胞和分子机制，探寻其关键通路和靶点，从而建立缓解微重力导致骨质丢失的方法，对于我国中长期载人航天任务及空间站的顺利运行十分必要。然而目前仍有一些问题需要解决，如微重力影响骨组织中各细胞的始动因素及关键分子尚不十分明确，其次缺乏微重力环境下各种骨组织细胞相互作用的研究。