4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氢-1，4-苯并噁嗪-3-酮抗血小板聚集机制研究

单一桓，邓 楠，祁真平，左 华

（西南大学药学院，重庆 400716）

0 引言

血液中凝血和抗凝血、纤溶和抗纤溶的动态平衡维持着血液的流动性。在正常循环血液中，血小板处于静息状态。当凝血功能和抗凝血功能失去平衡时，血小板就会受到刺激，发生变性、黏附、释放、聚集等活化反应，引发血栓形成［1］，进而导致缺血性脑卒中、心肌梗塞等心、脑、肺循环系统疾病，严重危害人类生命健康［2-3］。

抗血小板聚集药物能够有效预防血栓的形成。目前常用的抗血小板药物主要有4类：（1）影响花生四烯酸代谢药物；（2）P2Y12受体拮抗剂；（3）血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂；（4）磷酸二酯酶抑制剂［4］。近几年研究发现，苯并噁嗪酮衍生物具有高效的抗血小板聚集作用［5-7］。Ilaš等［8］合成了一系列2H-1，4-苯并噁嗪衍生物并证实了该类化合物具有理想的Ⅱb/Ⅲa受体拮抗作用。本课题组的前期研究表明，2H-1，4-苯并噁嗪酮类衍生物具有血小板聚集抑制活性，为血栓性疾病的防治带来了新的突破［9-12］。本文在此基础上，对4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氢-1，4-苯并噁嗪-3-酮（见图1）的抗血小板聚集机制进行了研究。

图1 4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氢-1，4-苯并噁嗪-3-酮的化学结构式

1 材料与方法

1.1 实验动物

新西兰兔，雄性八只，购自重庆市南山中药研究院。2018年3月至6月，在西南大学药学院动物房饲养，期间自由进食和饮水，每天照明12小时（8：00—20：00）。

1.2 实验材料

4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氢-1，4-苯并噁嗪-3-酮，由本实验室合成。枸橼酸钠，采购自天津瑞金特化学品有限公司。胶原Ⅰ购自美国Sigma-Aldrich公司。氯化钠、PBS（pH7.4），采购自成都市科龙化工试剂厂。DMSO购自重庆川东化工有限公司。TXB2、5-HTELISA试剂盒购自美国R&D Systems公司。阿司匹林肠溶片购自德国拜耳医药保健有限公司。盐酸沙格雷酯片购自日本田边三菱制药株式会社。

1.3 实验方法

1.3.1 实验样品的制备

用0.1%DMSO溶液将4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氢-1，4-苯并噁嗪-3-酮（由本实验室前期合成［12］）配制成浓度10μM的溶液；阳性对照药品（阿司匹林、盐酸沙格雷酯）用0.1%DMSO溶液配制成浓度100μM的储备液，4°C保存备用；配制3.8%（W/V）枸橼酸钠溶液作为抗凝剂；胶原Ⅰ用PBS溶液配置成浓度4μg/mL的溶液作为诱导剂，4℃保存备用。

1.3.2 血浆样品的制备

每次实验采取同一只兔子的血液，以避免兔子个体差异的影响。将兔子仰卧固定好，心脏动脉采血。加入抗凝剂3.8%枸橼酸钠溶液，以抗凝剂∶血液=1∶9（V∶V）的比例抗凝。将血液样品在室温下以800 rpm转速离心10 min，小心吸取上层清液，即得到富血小板血浆（PRP）。将剩下的血以3 000 rpm的转速离心15 min，得到贫血小板血浆（PPP）。最后用PPP调整PRP的血小板数量至（200±50）×106/mL。整个流程必须在3 h内完成［9］。

1.3.3 血小板中血栓素TXB2的变化

空白对照组、阳性对照组和实验组，每组进行3次重复试验。在9个EP管分别加入170μL配制好的富血小板血浆（PRP），在37℃水浴中孵育5 min。然后在各管中加入10μL 4μg/mL的胶原Ⅰ诱导剂，37℃下反应5 min，往相应管中加入20μL 0.01%的DMSO空白对照溶液、20μL 10μM阳性对照药物阿司匹林溶液、20μL 10μM的4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氢-1，4-苯并噁嗪-3-酮DMSO溶液，37℃水浴中孵育5min后取出。以3 000 rpm转速在4℃下离心30 min，取10μL上清液作为测定TXB2的样品，按照TXB2ELISA试剂盒说明书进行操作，用酶标仪测定450 nm下的OD值，计算样品浓度。

1.3.4 血小板中5-HT的变化

空白对照组、阳性对照组和实验组，每组进行3次重复试验。在9个EP管中分别加入170μL配制好的富血小板血浆（PRP），在37℃水浴中孵育5 min。然后在各管中加入10μL 4μg/mL胶原Ⅰ诱导剂，37℃水浴中孵育5 min。往相应管中加入空白对照溶液0.01%的DMSO水溶液20μL、阳性对照药物盐酸沙格雷酯溶液、20μL 10μM的4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氢-1，4-苯并噁嗪-3-酮溶液20μL，37℃水浴中孵育5 min后取出，以3 000 rpm转速在4℃离心30 min，取10μL上清液作为测定5-HT的样品，按照5-HTELISA试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450 nm下的OD值，计算样品浓度。

1.4 统计学处理

用Excel软件计算均值和标准差，SPSS软件计算P值。计量资料以x±s表示，采用t检验方法进行组间差异比较，以P<0.05为差异作为具有统计学意义的标准。

2 结果

2.1 血小板中血栓素TXB2释放量的变化

TXB2标准品浓度与OD值的标准曲线如图2所示，OD值与TXB2标准品浓度的线性方程为y=0.003 4x，相关系数r=0.979 1，TXB2释放量与OD值具有线性相关性。

图2 TXB2（释放量）标准曲线

空白对照组、阳性对照组（10μM）和实验组（10 μM）的TXB2释放量（x±s）分别为 186.8±31.2，111.8±16.5和76.5±6.9（pg/mL）（见图3）。按照公式（1）和公式（2）计算得：对于TXB2的释放量，阳性对照组比空白对照组低40%，实验组比空白对照组低59.0%，且P<0.05，具有统计学意义，说明4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氢-1，4-苯并噁嗪-3-酮具有显著的抑制血小板TXB2释放的作用。

图3 4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氢-1，4-苯并噁嗪-3-酮对血小板中TXB2释放量的影响

2.2 血小板中5-HT的释放量实验结果

5-HT标准品浓度与OD值的标准曲线如图4所示，OD值与5-HT标准品浓度的线性方程为y=0.021 4x，相关系数r=0.996 1，5-HT释放量与OD值具有线性相关性。

图4 5-HT释放量标准曲线

空白对照组、阳性对照组（10μM）和实验组（10 μM）的5-HT释放量（pg/mL）（±s）分别为63.8±0.5，76.5±6.3和77.2±1.9（见图5）。对于5-HT释放量，按照公式（3）和（4）得：阳性对照组比空白对照组高19.8%，实验组比空白对照组高21.0%，且P<0.05，具有统计学意义，表明4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氢-1，4-苯并噁嗪-3-酮能够抑制5-HT与其受体结合，进而抑制血小板聚集。

图5 4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氢-1，4-苯并噁嗪-3-酮对血小板中5-HT释放量的影响

3 讨论

目前心血管疾病如急性心肌梗死、脑卒中等，已被列为严重危害人类健康的疾病，该类疾病与血栓栓塞密切相关。血小板在血栓的形成和发展阶段起着核心作用，所以抗血小板聚集药物能够有效地预防栓塞，治疗心血管疾病。目前有文献报道［13］，2H-1，4苯并噁嗪酮类化合物具有理想的GPⅡb/Ⅲa受体拮抗作用，但是对于其不同衍生物的抗血小板聚集的机制仍需进一步研究。针对血小板聚集过程中产生的一系列反应如花生四烯酸（Arachidonic Acid，AA）代谢、产生血栓烷A2（TXA2）并激活血小板上的A2受体、释放出ADP、5-HT等导致血小板GPⅡb/Ⅲa复合物的构型改变、形成黏附分子受体并通过与纤维蛋白原的结合而使血小板之间相互黏附和聚集成团,在血管破损处形成早期止血血栓，我们研究了其中两种可能的抗血小板聚集机制：抑制血小板TXB2的释放和阻断5-HT与其受体的结合［14］。

本研究显示，4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氢-1，4-苯并噁嗪-3-酮显著减少了胶原诱导产生的TXB2的含量。TXB2是由TXA2代谢形成的稳定产物［15］，表明4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氢-1，4-苯并噁嗪-3-酮能够显著抑制TXB2的释放，进而抑制血小板的聚集。5-HT可以通过与G-蛋白偶联受体结合发挥生理功能引起血管收缩，导致血栓形成［11］。4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氢-1，4-苯并噁嗪-3-酮作用于胶原诱导后的血小板时，5-HT的含量显著增加，说明4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氢-1，4-苯并噁嗪-3-酮阻断了5-HT与G-蛋白偶联受体的结合，使游离的5-HT增多，进而抑制血小板的聚集。

综上所述，化合物4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氢-1，4-苯并噁嗪-3-酮可以通过抑制血小板TXB2的释放以及阻断5-HT与其受体结合的机制来抑制血小板聚集，且抑制血小板TXB2释放的机制作用更显著。