痰热清注射液对大鼠的急毒及长毒试验研究

张小利，张联众，杜学航

（1.上海凯宝药业股份有限公司，上海 201401；2.甘肃省白银市平川区疾病预防控制中心，甘肃白银 730913）

0 引言

肺炎是指终末气道、肺泡和肺间质的炎症，是较为常见的呼吸道系统疾病；临床治疗多以抗生素和抗病毒药物为主，但是存在耐药、抗感染等诸多等问题［1］。中医认为，肺炎临床证型以风温闭肺、痰热奎肺、痰热结胸及气阴两伤为主［2］。痰热清注射液是由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘等组成，功能清热、解毒、化痰，用于治疗急性肺炎、急性支气管炎属风温肺热病痰热阻肺证者［3］。目前痰热清注射液亦用于治疗新型冠状病毒性肺炎（COVID-19）［4］。为进一步明确痰热清注射液的安全性，观察其毒性反应症状，本实验就其急性及长期给药可能产生的毒性反应进行观察，对其安全剂量范围予以客观评判。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级Wistar大鼠160只，雌雄各半，体质量78.1～107.8 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，其中40只用于急毒实验，实验动物合格证号：SCXK（沪）2012—0002。大鼠饲养于上海中医药大学SPF级屏障设施［SYXK（沪）2014—0008］，环境温度20～24℃，相对湿度42%～67%，换气次数≥15次/h。人工控制照明，昼夜交替时间为12 h/12 h。所有动物实验严格遵守上海中医药大学实验动物伦理委员会的要求。

1.2 药品与主要试剂

痰热清注射液，上海凯宝药业股份有限公司生产（棕红色澄明液体，规格：10 mL/支，含量：0.335 g/mL（生药量/药液），批号：1308317），临用时用氯化钠注射液稀释成所需浓度的溶液；痰热清注射液空白对照液，上海凯宝药业股份有限公司生产（无色澄明液体，规格：10 mL/支，批号：1308317-1），临用时氯化钠注射液稀释成所需浓度的溶液；氯化钠注射液，上华裕（无锡）制药有限公司生产（批号：14057402）。

血液生化检测试剂盒（日本世诺临床诊断制品株式会社）；离子检测试剂盒（上海伊华医学科技有限公司）；血液学检测试剂盒（德国西门子医疗诊断产品有限公司）；凝血指标测定试剂盒（德国西门子医疗诊断产品有限公司）；异氟烷，河北九派制药股份有限公司生产（批号：130101）。上述药品均密封，避光，置阴凉干燥处保存；试剂均在4℃冰箱保存。

1.3 实验仪器

BAYER ADVIA 120五分类血球仪（德国拜耳公司）；SYSMEX CA-500全自动血凝分析仪（日本希森美康株式会社）；日立7080全自动生化分析仪（日本日立株式会社）；XD683型电解质分析仪（上海迅达公司）；罗氏朱丽亚II型尿液分析仪（德国罗氏诊断有限公司）；YZ11D检眼镜（苏州六六视觉科技股份有限公司）；VIP-5全封闭组织脱水机（日本樱花检验仪器株式会社）；HistoStar石蜡包埋机（赛默飞世尔公司）；HM340E轮转式组织切片机（德国美康公司）；OLYMPUSBH-2光学显微镜、BX51型系统显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；BSA2201-CW精密天平（德国赛多利斯公司）；AR2130电子天平（美国奥豪斯公司）。

2 方法

2.1 急性毒性（急毒）实验

取检疫合格的Wistar大鼠40只，按体质量分层随机分为2组，即对照组及给药组，每组20只，雌雄各半。给药组大鼠按最大给药容量（20 mL/kg）尾静脉注射痰热清原液，对照组给予等容量痰热清注射液空白对照液，给药1次，恢复14 d。观察大鼠的一般体征、行为运动和死亡等情况，给药后4 h内严密观察。15 d时解剖观察心、肝、脾、肺和肾等主要脏器的颜色、形状和大小，如有异常则采集进行组织病理学检查。

2.2 3个月长期毒性（长毒）实验

取检疫合格的Wistar大鼠120只，按体质量分层随机分为4组，每组30只，雌雄各半，即痰热清注射液低剂量（1∶7稀释，给药容量20 mL/kg，相当于2.50 mL/kg痰热清注射液原液）组、中剂量（1∶4稀释，给药容量20 mL/kg，相当于4.00 mL/kg痰热清注射液原液）组、高剂量（1∶2稀释，给药容量20 mL/kg，相当于6.67 mL/kg痰热清注射液原液）及对照（1∶4稀释，给药容量20 mL/kg，相当于4.00 mL/kg空白对照原液）组。采用尾静脉注射给药方式，连续给药13周，停药恢复4周。于给药第13周和17周（恢复4周），每组分别取20只、10只大鼠进行解剖，雌雄各半，进行血液学、血凝、血清生化及组织病理学检测。

2.2.1 一般症状

给药期和停药后恢复期，每天观察1次外观、体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、皮毛、粪、尿等，每周称体质量和摄食量1次，发现死亡或濒死动物及时尸检。

2.2.2 血液学检测

白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞容积（HCT）、平均红细胞容积（MCV）、平均红细胞血红蛋白（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、血小板计数（PLT）、网织红细胞百分率（RETIC）、中性粒细胞百分率（NEUT%）、淋巴细胞百分率（LYMPH%）、单核细胞百分率（MONO%）、嗜酸细胞百分率（EOS%）、嗜碱细胞百分率（BASO%）。胸骨取骨髓涂片，甲醛固定。

2.2.3 血液生化检测

丙氨酸氨基转氨酶（ALT，连续监测法）、天门冬氨酸转氨酶（AST，连续监测法）、总蛋白（TP，双缩脲法）、白蛋白（ALB，溴甲酚緑法）、总胆红素（TBIL，钒酸氧化法）、直接胆红素（DBIL）、碱性磷酸酶（ALP，连续监测法）、γ-谷氨酰转移酶（GGT，速率法）、血糖（GLU，葡萄糖脱氢酶法）、尿素氮（BUN，紫外法）、肌酐（CREAT，酶法）、总胆固醇（CHOLT，酶法）、甘油三脂（TG，酶法）、肌酸激酶（CK，酶反应动力学法），钠、钾、氯离子。

2.2.4 凝血指标检测

凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白酶原（FIB）。

2.2.5 系统尸检和病理组织学检查

取各组大鼠脑、垂体、脊髓（颈、胸、腰段）、胸腺、甲状腺、唾液腺、食管、胃、大肠和小肠、肝、脾、肾上腺、肾、淋巴结（食管淋巴结、肠系膜淋巴结)、胰腺、气管、肺、心、主动脉、膀胱、坐骨神经、胸骨，雄性动物睾丸、附睾、前列腺或雌性动物乳腺、子宫、卵巢及尸检时肉眼发现的可疑脏器，放入10%福尔马林固定，HE染色。高剂量组和对照组的器官和组织进行组织病理学检查，如果高剂量组出现组织病理学变化时，那么低剂量组也应进行组织病理学检查以确定剂量-反应关系。其中取材后需称定质量的器官：脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、睾丸、附睾或子宫、卵巢。计算主要脏器脏器系数、脏脑比值（g/100 g体质量）。

2.3 统计方法

本试验所有数据均采用SPSS20.0软件统计，所有计量数据的结果均使用平均值±标准偏差（x±s）表示。计量资料比较采用方差分析，若方差齐，则进行单因素方差分析（ANOVA）；若有显著性差别（P≤0.05），则各剂量组与对照组间做Dunnet检验；若方差不齐，则进行非参数检验（Kruskal-Wallis检验）；若K-W检验有统计学差异（P≤0.05），则各剂量组与对照组间做Mann-Whitney U检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 急性毒性（急毒）实验

大鼠在给予痰热清注射液或痰热清注射液空白对照液后30 min内，两组大鼠均可见活动减少。在随后的观察期内，两组大鼠均未见异常反应，大鼠活动、精神状况良好，大、小便如常。试验结束时动物进行大体解剖，肉眼观察心脏、肺脏、肾脏、肝脏、脾脏、胃肠道等内脏，两组大鼠均无异常，未发现有出血点、水肿等情况。15 d内各组大鼠无一死亡。

3.2 3个月长期毒性（长毒）实验

3.2.1 一般症状

大鼠给药3个月及恢复期内，无大鼠死亡。高剂量组1只雄性大鼠（动物编号：4006）在给药第56日观察到右后肢踝关节以下部分水肿，持续6 d后恢复；对照组1只雄性大鼠（动物编号：1010）在给药第49日观察到双侧后肢踝关节以下部分水肿，持续9 d后恢复；其余对照组和各给药组大鼠精神状态良好，行为活动、呼吸正常，唾液腺、泪腺等腺体未见有异常分泌，皮毛光滑，粪便和尿液也未见异常。

3.2.2 体质量和食耗量

给药3个月及恢复期末，各给药组体重与对照组比较均无显著性差异（P>0.05）。与同期对照组比较，雄性高剂量组在第6周摄食量显著偏低（P<0.05），下降约2.9%；雌性中剂量组分别在第6，10，13周摄食量显著低于对照组（P<0.05），分别下降约11.2%，7.5%，10.8%；高剂量组分别在第3，6，10，12，13周摄食量显著或极显著低于对照组（P<0.05），分别下降约8.2%，15.0%，7.0%，6.7%，10.3%；其余大鼠摄食量均无显著性差异（P>0.05）。结果如图1—2所示。

图1 大鼠尾静脉注射痰热清注射液3个月大鼠体质量的经时变化

图2 大鼠尾静脉注射痰热清注射液3个月大鼠食耗量的经时变化

表1 大鼠尾静脉注射痰热清注射液3个月对长毒实验大鼠血液学指标的影响(±s)

表1 大鼠尾静脉注射痰热清注射液3个月对长毒实验大鼠血液学指标的影响(±s)

注：1.3个月给药期末n=10，恢复期末n=5；2.与对照组比较*P<0.05。

试验周期组别恢复期末3个月给药期末对照组低剂量组中剂量组高剂量组对照组低剂量组中剂量组高剂量组雌鼠Baso%0.1±0.1 0.1±0.1 0.1±0.1 0.1±0.1 0.1±0.0 0.1±0.1 0.1±0.0 0.1±0.0雄鼠Baso%0.2±0.1 0.1±0.1 0.1±0.1*0.1±0.0 0.0±0.0 0.1±0.0*0.0±0.1 0.0±0.0

3.2.3 眼科检查

给药3个月及恢复期末各组动物眼科检查未见与药物相关改变。

3.2.4 血液学指标

给药3个月，与对照组相比，雄性大鼠Baso%中剂量组偏低（P<0.05），其余剂量组各项血液学检测指标，均无显著性差异（P>0.05）；雌性大鼠各剂量组各项血液学检测指标，均无显著性差异（P>0.05）。恢复期末，与对照组相比，雄性大鼠Baso%低剂量组偏高（P<0.05），其余剂量组各项血液学检测指标，均无显著性差异（P>0.05）；雌性大鼠各剂量组各项血液学检测指标，均无显著性差异（P>0.05）。变化指标如表1所示。

3.2.5 血液生化指标

给药3个月，雄性大鼠各剂量组各项指标与对照组相比无显著性差异（P>0.05）；雌性大鼠中、高剂量组的BUN偏分别升高约22.6%，16.7%，与对照组比较有显著性差异（P<0.05，P<0.01），而CREA则未见明显变化；其余各剂量组各指标，与对照组比较无显著性差异（P>0.05）。恢复期末，雄性大鼠高剂量组的Na+，Cl-偏高，分别偏高约1.2%，0.8%，与对照组比较有显著性差异（P<0.05，P<0.01）；其余各剂量组各指标，与对照组比较无显著性差异（P>0.05）；雌性大鼠各剂量组各指标，与对照组比较无显著性差异（P>0.05）。变化指标如表2所示。

3.2.6 凝血指标

给药3个月及恢复期末，各给药组各项凝血指标与对照组比较未见明显差异（P>0.05）。

3.2.7 脏器质量、脏器系数及脏脑系数

给药3个月，雄性低、中剂量组肾脏脏脑比与对照组比较偏高，有显著性差异（P<0.05）；雌性低剂量组脾脏脏体比与对照组比较偏高，有极显著性差异（P<0.01）；其余各给药组的脏器绝对值、脏体比及脏脑比与对照组比较均无明显差异。恢复期末，雄性低、中剂量组肾脏脏体比与对照组比较偏高，有极显著性差异（P<0.01或P<0.05）；其余各给药组的脏器绝对值、脏体比及脏脑比与对照组比较均无明显差异。

3.2.9 大体解剖及组织病理学检查

给药3个月及恢复期末进行大体解剖检查，主要脏器组织及胸腔、腹腔未检出肉眼可见病变。给药3个月及恢复期末组织病理学检查，各剂量给药组的部分动物肾小管上皮细胞内可见轻度或轻微的黄褐色色素沉着，而同期的对照组动物未见同样变化，结果如图3所示。其余个别脏器组织病理改变无明显剂量效应关系，判断为非药物因素引起。各组动物肾小管上皮细胞内色素沉着的程度及发生率，如表3所示。

4 讨论

4.1 急性毒性(急毒)实验

痰热清注射液的人临床常用量一般为20 mL原液，重症患者一次可用40 mL，按每人60 kg计算，则剂量约为0.33或0.67 mL/kg/d。大鼠按痰热清注射液原液和最大给药容量（20 mL/kg）尾静脉注射，约相当于人临床常用单日剂量（mL/kg）的61倍，重症患者的30倍。本次试验15 d内无一大鼠死亡，给药后30 min内，给药组和对照组大鼠均可见运动低下，考虑此反应可能缘于大容量静脉注射引起，与供试品本身无关。

表2 大鼠尾静脉注射痰热清注射液3个月对长毒实验大鼠血液生化指标的影响(±s)

表2 大鼠尾静脉注射痰热清注射液3个月对长毒实验大鼠血液生化指标的影响(±s)

注：1.3个月给药期末n=10，恢复期末n=5；2.与对照组比较*P<0.05，**P<0.05。

试验周期恢复期末组别雌鼠雄鼠3个月给药期末对照组恢复期末中剂量组高剂量组对照组恢复期末中剂量组高剂量组BUN 8.4±1.1 8.7±1.1 10.3±1.6**9.8±1.4*8.4±1.0 9.1±1.5 10.2±2.0 9.9±0.6 Na+141.7±0.7 141.7±1.2 141.8±0.8 141.8±1.3 141.4±0.8 141.6±1.0 141.5±0.8 141.9±1.0 Cl-107.4±0.4 107.4±0.7 107.9±0.7 107.8±1.0 107.8±1.4 108.0±1.1 108.1±0.9 108.0±0.9 BUN 7.7±0.6 7.8±1.1 7.5±1.0 7.4±0.6 7.3±0.9 7.9±0.6 7.7±0.7 8.0±0.9 Na+142.7±0.6 142.4±1.0 142.2±0.7 142.0±0.8 141.3±0.9 141.4±0.4 141.8±0.7 143.0±0.8**Cl-106.9±0.3 106.6±0.8 106.9±0.4 106.7±0.5 107.5±0.8 107.6±0.4 107.8±0.4 108.4±0.3*

图3 大鼠尾静脉注射痰热清注射液3个月对肾小管上皮细胞内黄褐色色素沉着的影响

表3 大鼠尾静脉注射痰热清注射液3个月对长毒实验肾小管上皮细胞内色素沉着的程度及发生率的影响

4.2 3个月长期毒性（长毒）实验

预试发现，大鼠尾静脉注射1∶1稀释的痰热清注射液原液对血管刺激较大，而1∶2稀释适合长期给药。于是高剂量按可操作的最大给药浓度（1∶2稀释）和静脉注射最大给药容量（20 mL/kg），相当于原液6.67 mL/kg给药，约为人临床单日剂量（mL/kg）的20倍，重症患者的10.0倍；中剂量组1∶4稀释，相当于给予原液4.00 mL/kg，约为人临床单日剂量的12倍，重症患者的6.0倍；低剂量1∶7稀释，相当于给予原液2.50 mL/kg，约为人临床单日剂量（mL/kg）的7.6倍，重症患者的3.7倍，略高于大鼠药效学研究的起效剂量（2.00 mL原液/kg）。痰热清注射液中含有10%的辅料丙二醇，所以对照组给予与中剂量组等量的痰热清注射液空白对照，即4.00 mL空白对照原液/kg。

给药期间高剂量组个别动物出现水肿，考虑到对照组亦出现水肿，分析认为高剂量组出现的水肿与受试药物作用无关。血液学指标Baso%的改变无量效关系且绝对值变化较小，故不认为与受试药物相关。恢复期雄性大鼠高剂量组的Na+，Cl-偏高，但均在本中心背景数据范围之内，分析认为无毒理学意义。虽然个别器官出现脏器系数或脏脑系数的改变，但上述变化无明显剂量关系，且组织病理学检查未见明显异常，综合分析认为无毒理学意义。

雄性大鼠高剂量组在第6周摄食量显著低于对照组，雌性大鼠中、高剂量组的摄食量在部分周次，尤其从高剂量组从第10周开始显著低于对照组，分析认为高浓度大剂量静脉注射痰热清对大鼠摄食量有一定的抑制作用。

出现于给药期末各剂量给药组，部分动物肾小管上皮细胞内的黄褐色色素沉着具有一定的剂量相关性，且对照组动物未见同样变化，考虑与供试品有关。根据这些色素的形态学特征综合分析认为，这种色素沉着可能系供试品的某种代谢产物在排泄过程中被肾小管重吸收所致，而非供试品的毒性作用。因其程度轻微，未对肾功能产生明显影响。恢复期末，虽然各剂量给药组仍有部分动物肾小管上皮细胞内存在这种黄褐色色素，但其程度及发生率明显下降（给药3个月：高剂量组19+，1±，中剂量组4+，8±；恢复期：高剂量组0+，9±，中剂量0+，4±，详见表3）。说明停药4周后肾小管上皮细胞内的色素沉着可以得到很大程度的恢复。

结合给药各剂量组动物个体数据的相关性分析，包括BUN、CREA、脏器指数、肾小管上皮细胞内的黄褐色色素沉着等，发现以上几项变化在动物个体中并无明显的相关性，所以分析此现象认为无明显毒理学意义。

综上，大鼠急毒的安全剂量为：20 mL痰热清原液/kg；大鼠长毒的安全剂量为：6.67 mL原液/kg。但对于长期高剂量给药，建议就食耗量作进一步观察。