无创胚胎染色体筛查技术对单囊胚冻胚复苏移植临床结局的影响▲

肖 露 权 利 梁红星 廖美霞 范晓波 陈西平 李宝香 涂 剑

(湖南省岳阳市妇幼保健院生殖医学中心，岳阳市 414000，电子邮箱：xl2012cy@163.com)

染色体筛查是辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)的重要组成部分。胚胎植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening,PGS)是胚胎染色体筛查的重要技术手段，它能提高临床妊娠率，降低早期流产率，并减少畸形儿的出生[1]。但PGS是一种有创的染色体筛查技术，可能会对胚胎后续发育造成潜在的、尚未知晓的影响。无创胚胎染色体筛查技术(noninvasive chromosome screening,NICS)通过检测胚胎培养液及囊腔液样本分析胚胎染色体的拷贝数，其结果与胚胎样本染色体拷贝数高度相关，敏感性和特异性均高达80%以上[2]。但目前未见有关NICS检测提示染色体正常的囊胚移植的临床结局的研究报道。本研究比较NICS检测提示为染色体正常的囊胚移植与Gardner囊胚评分[3]法评估为形态学质量为优的囊胚移植之间的临床结局，探讨NICS检测对单囊胚移植临床结局的影响，旨在为ART周期中运用NICS检测染色体提供临床依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析2016年11月至2019年9月在我院生殖医学中心行体外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryo transfer,IVF-ET)的372例不孕夫妇(372个移植周期)的临床资料。纳入标准：(1)女方年龄35～40岁；(2)ART周期中获卵≥15个或者人绒毛促性腺激素注射当日血清雌二醇水平≥5 000 pg/mL；(3)18 kg/m2≤女方体质指数≤28 kg/m2；(4)同意选择单囊胚冻胚复苏移植；(5)根据Gardner囊胚评分法评估形态学质量，符合移植条件的囊胚数≥2个；(6)无内科并发症；(7)符合国家计划生育政策。排除标准：(1)夫妻任一方有ART治疗禁忌证；(2)女方既往自发性流产>3次；(3)女方单侧卵巢切除；(4)有如下明确原因的不孕患者，如单侧或双侧输卵管积液、瘢痕子宫、子宫畸形、子宫内膜异位症、子宫腺肌症、子宫内膜息肉、宫腔粘连或其他影响子宫内膜环境的病变；(5)女方患有不宜生育的严重遗传性疾病、严重躯体疾病、精神心理障碍等。在移植前所有囊胚形态学质量经Gardner囊胚评分[3]评估都符合移植要求。将其中愿意接受NICS检测并且检测结果显示囊胚染色体拷贝数正常的75例，设为染色体拷贝数正常囊胚移植组(A组)；愿意接受NICS检测并且检测结果显示囊胚染色体拷贝数异常的73个优质囊胚将不用于临床移植，不纳入任何一组；其余224例设为形态学优质囊胚移植组(B组)。两组的女方年龄、不孕年限、体质指数和移植日子宫内膜厚度比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。本研究已通过岳阳市妇幼保健院医学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

表1 两组间基本资料的比较(x±s)

1.2 IVF-ET及NICS检测 所有女方均接受本中心常规采用的促性腺激素释放激素激动剂降调节进行超排卵：采用早卵泡期长效长促排卵方案，月经第1～4天行阴道B超和血促卵泡激素、黄体生成素、雌二醇、孕酮检查，予以注射长效达菲林(生产厂家：Ipsen Pharma Biotech；规格：3.75 mg/支)3.75 mg，28～30 d后复查阴道B超和血促卵泡激素、促黄体生成素、雌二醇、孕酮值。若达到降调标准(降调标准：卵泡直径≤5～8 mm、子宫内膜≤5 mm、雌二醇<50 pg/mL、促卵泡激素及促黄体生成素<5 mIU/mL、孕酮<0.9 ng/mL)，予以注射Gn(果纳芬，生产厂家：MerckSeronoS.p.A；规格：300 IU/0.5 mL)启动。至扳机时机(扳机时机：主导卵泡群直径≥17 mm与≥14 mm卵泡数的比值达60%～70%)，予注射艾泽(规格：250 μg:0.5 mL)扳机。扳机后36 h采卵，行体外受精。两组均行体外受精，将受精卵置于培养箱内采用G-1TM培养液(瑞典Vitrolife公司,型号：10128)行单微滴单胚胎培养72 h后，换G-2TM(瑞典Vitrolife公司,型号：10132)囊胚培养液继续培养。培养液为Vitrolife公司G5系列培养液，培养箱为美国COOK公司K-MINC-1000型培养箱。

培养至120 h(D5)～144 h(D6)，行形态学评估后，对接受NICS检测的患者囊胚进行激光皱缩，5～10 min后取30 μL囊胚培养液，送亿康基因有限公司进行NICS检测(多次退火环状循环扩增技术单细胞全基因组扩增+高通量测序)，筛选染色体正常胚胎进行移植；不接受NICS检测的形态学优质囊胚直接进行移植[3-4]。

1.3 观察指标 观察两组患者的临床结局，包括临床妊娠率、早期流产率、持续妊娠率、异位妊娠率、活产率、新生儿畸形率。判断标准：移植后4周行B超检查，宫腔内见妊娠囊确定为临床妊娠；发生在孕12周以前的流产定义为早期流产；持续妊娠是指怀孕持续到20周或以后；发生在子宫底或子宫体之外的妊娠定义为异位妊娠，异位妊娠亦记为临床妊娠；胎儿分娩后，存在呼吸或其他生命征象(如心脏跳动等)均被定义为活产婴儿；胎儿出生前已经存在的结构或功能异常为新生儿畸形。临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植总周期数×100%；早期流产率=早期流产周期数/临床妊娠周期数×100%；持续妊娠率=持续妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；异位妊娠率=异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；活产率=有活产周期数/移植总周期数×100%；新生儿畸形率=畸形婴儿数/活产婴儿数×100%。

1.4 统计学分析 采用SPSS 23.0和GraphPad Prism 7进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用两样本独立t检验；计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 NICS检测情况 对148枚Gardner囊胚评分法形态学质量为优的囊胚(见图1)进行NICS检测，结果提示75枚Gardner囊胚评分法形态学质量为优的囊胚的染色体拷贝数正常，其余73枚Gardner囊胚评分法形态学质量为优的囊胚的染色体拷贝数异常(见图2)，包括39枚为非整倍体，22枚为嵌合体，12枚为染色体检测结果不明确。将NICS检测染色体拷贝数正常的Gardner囊胚评分法形态学质量为优的囊胚进行移植，而染色体拷贝数异常的Gardner囊胚评分法形态学质量为优的囊胚终止ART周期。

图1 D5～D6 Gardner囊胚评分法形态学质量为优的囊胚

图2 NICS检测形态学优质囊胚的染色体拷贝数结果

2.2 两组临床结局比较 A组的新生儿畸形率低于B组，活产率高于B组(均P<0.05)；但两组之间的临床妊娠率、早期流产率、持续妊娠率和异位妊娠率差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 两组临床结局比较

3 讨 论

随着二孩政策的全面放开，许多高龄女性渴望再生育，但随着年龄的增长，女性生殖能力逐渐下降，尤其35岁以后下降更为明显。这促使有生育要求的高龄孕妇选择通过ART来实现生育。研究表明，ART受孕与自然受孕的新生儿出生缺陷发生率差异无统计学意义[5-8]。但通过ART方式获得的胚胎，仍有40%～60%存在染色体异常，且随孕妇年龄增大，染色体异常的风险呈上升趋势[9]。而胚胎染色体异常时导致ART失败的主要原因[10]。ART周期中PGS是胚胎染色体筛查的重要技术手段，采用PGS进行胚胎染色体筛查，可降低试管婴儿流产率，提高临床妊娠率[11-12]。但PGS的标本采集方式对胚胎存在一定的创伤。研究表明，有创性的活检有可能会引起胚胎发育节点时间延长，并造成表观遗传修饰异常[13-14]和胎盘异常[15-16]等不利影响。

本研究中，A组的新生儿畸形率低于B组，而活产率高于B组(P<0.05)；但两组之间的临床妊娠率、持续妊娠率、早期流产率、异位妊娠率差异无统计学意义(P>0.05)。本研究对Gardner囊胚评分法形态学质量为优的囊胚进行NICS检测，发现这些囊胚部分亦存在染色体拷贝数异常，这种异常可能导致某些基因(如MPP1)的缺失、减少或增多[17]，从而导致活产率降低和新生儿畸形率升高[18]。

综上所述，与单纯传统胚胎形态学评分比较，联合NICS能够提高单囊胚冻胚复苏移植的活产率，降低新生儿畸形率。这为临床ART周期中染色体筛查提供新的思路，而合理应用NICS能更好地实现ART技术中优生优育的目的。但由于本研究为单中心回顾性研究，同时周期数量有限，所得结果可能存在一定的偏差，今后还需进一步进行多中心、多周期的前瞻性或回顾性研究以验证。