电针对颅脑损伤后认知障碍大鼠海马磷酸化认知缺陷突触相关蛋白的调节作用※

郭新荣 李婉露 刘 宁 马小卫

(陕西中医药大学针灸推拿学院，陕西 咸阳 712046)

颅脑损伤(traumatic brain injury，TBI)临床常表现为意识丧失、失语、头痛、眩晕及认知障碍(cognitive dysfunction，CD)等[1-2]，CD是多数TBI患者伴有的最持久、最严重的症状之一，特别是学习新知识能力减退，给个人、家庭和社会带来沉重负担[3]。临床实践表明电针治疗TBI后CD疗效肯定[4-5]。为进一步探讨其作用机制，本实验研究电针对TBI后CD大鼠海马磷酸化认知缺陷突触相关蛋白(SynGAP)的调控作用，以期为电针治疗TBI后CD的临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD雄性大鼠80只，体质量220～240 g，购自西安交通大学医学院实验动物中心，动物合格证号：SCXK(陕)2012-003号。饲养环境：温度18～24 ℃,湿度60%～70%，自由饮水，自然光照。

1.1.2 主要试剂 4%多聚甲醛溶液、含戊二醛的4%多聚甲醛溶液(美国Sigma公司)；2.5%戊二醛溶液(湖北新景新材料有限公司)；兔抗SynGAP一抗(武汉博士德生物工程有限公司)；即用型链霉亲和素—生物素—过氧化物酶复合物(SABC)免疫组化染色试剂盒(兔源二抗)(武汉博士德生物工程有限公司)；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；2%戊巴比妥钠溶液[默克化工技术(上海)有限公司]；硫酸庆大霉素注射液(国药集团容生制药有限公司，国药准字H41024153)；注射用氨苄西林钠[石药集团中诺药业(石家庄)有限公司，国药准字H13021267]。

1.1.3 主要仪器 脑立体定位仪(ST-3ND型，成都仪器厂)；电子颅脑损伤仪(eCCI-6.3型，美国VCU大学)；自动酶标仪(Spectra M5型，美国Molecular Devices公司)；MORRIS水迷宫视频分析系统(RD1101-MWM-G型，上海移数信息科技有限公司)；超声波细胞粉碎仪(JY92-Ⅱ型，宁波新艺超声设备有限公司)；微型台式高速冷冻离心机(5417R型，德国Eppendorf公司)；脱色摇床(TY-80S型，南京新校园生物技术研究所)；基础型电源(美国Bio-Rad公司)；电泳槽(美国Bio-Rad公司)；转印槽(美国Bio-Rad公司)；正置研究级显微镜(日本Nikon)；日立透射电子显微镜(H-7650型，日本日立)；电针仪(G6805-1A型，上海华谊医用仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物选择及分组 将80只SD大鼠适应性喂养3 d后开始用水迷宫实验筛选动物。每日上午1次，第4次水迷宫实验结束后，将>90 s始终不能找到平台的大鼠或<3 s能迅速找到平台的大鼠剔除，共剔除16只。余64只纳入研究，按照随机数字表法分为2组，即空白组10只、造模组54只。

1.2.2 模型制备[6]除空白组10只大鼠外，造模组54只大鼠均进行TBI模型制备。大鼠术前禁食禁水8 h，腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉，将大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪，头顶正中消毒，切开皮肤，剥离骨膜，暴露右顶骨，定位标记冠状缝后3 mm、中线右侧旁开2.5 mm，用微型磨钻钻半径为2 mm的骨窗，大鼠移至电子颅脑损伤仪上，设置参数为速度4 m/s、深度3 mm，打击；打击后如有出血，压迫止血，伤口处滴硫酸庆大霉素注射液4～5 滴，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮，缝合后用红霉素软膏涂抹缝合处及周围。将大鼠放在棉垫上，保持呼吸畅通，注意保暖，待大鼠苏醒后单笼饲养。术后予注射用氨苄西林钠125 mg肌肉注射抗感染，每日1次，连用3 d。造模组在TBI造模过程中死亡4只，余50只又按造模前4次水迷宫实验的逃避潜伏期成绩，从用时由多到少依次筛选出34只，随机分为模型组、电针组，各17只。对大鼠的处置严格按照《关于善待实验动物的指导性意见》[7]。

1.2.3 治疗方法 电针组大鼠予电针治疗。动物固定于自制鼠板上，取百会、人中、左侧内关、左侧后三里、左侧绝骨，定位参照《实验针灸学》[8]，百会：顶骨正中；人中：唇裂鼻尖下1 mm正中；内关：前肢内侧，离腕关节约3 mm的尺桡骨缝间；后三里：膝关节后外侧，在腓骨小头下约5 mm；绝骨：大鼠外踝上3 mm处。针刺操作：穴位消毒，选28号0.5寸华佗牌毫针，向前斜刺百会，直刺人中，直刺左侧内关、左侧后三里、左侧绝骨，刺入深度为(5.0±0.2) mm，各穴行捻转手法，得气后留针。后三里接电针仪负极，绝骨接电针仪正极，选2 Hz、1 mA、连续波，每次20 min，每日1次，5次为1个疗程，疗程间休息2 d，共治疗2个疗程。空白组、模型组大鼠，每日抓拿1次，同样方法固定20 min，常规消毒相应治疗穴位，疗程同电针组。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 水迷宫实验 自电针组大鼠进行电针治疗之日，各组随机取8只大鼠进行水迷宫实验。

1.3.1.1 定位航行实验 大鼠依次从4个象限进入水中，90 s内爬上平台的则记录所用时间，即为逃避潜伏期；90 s内未找到平台的则逃避潜伏期记录为90 s。各组试验期间，每日上午水迷宫实验测试1次，连续进行12次。

1.3.1.2 空间探索实验 最后一次定位航行实验结束后，撤除平台，将大鼠放入水中观察，记录大鼠90 s内经过原平台所在区域次数。

1.3.2 光镜观察海马CA1、CA3、DG区脑组织大体形态结构 治疗结束后，各组随机取2只大鼠，予0.9%氯化钠注射液200 mL、4%多聚甲醛溶液200 mL心脏灌注，断头取脑组织，辨认海马CA1、CA3、DG区。苏木素—伊红(HE)染色，光镜下观察大鼠海马CA1、CA3、DG区脑组织大体形态结构。

1.3.3 电镜观察海马CA1、CA3区脑组织超微结构 各组从余下大鼠中再随机取2只大鼠，予含戊二醛的4%多聚甲醛溶液300 mL进行心脏灌注固定。断头取脑组织，在蜡板上用手术刀片横断面切开脑组织，辨认海马CA1、CA3区，切下目标部位约2 mm×2 mm，放入2.5%戊二醛溶液中固定。送西安交通大学医学部电镜室，经清洗、脱水、浸透、包埋、切片、染色等步骤制成厚度50～70 nm的透射电镜切片，电镜下观察海马CA1、CA3区脑组织超微结构。

1.3.4 免疫印迹(Western Blot)检测海马区脑组织SynGAP含量 各组从余下大鼠中再随机取6只大鼠，心脏灌注后断头取脑组织，分离出海马区，称质量记录，并分成3份(每份>50 mg)，分别放入3个无菌离心管中，过液氮后放入超低温冰箱冻存。蛋白样品用高效RIPA法制备，BCA法测定蛋白浓度。上样蛋白的制备；制12%的分离胶、5%的浓缩胶，灌胶；上样；60 V低电压电泳30 min，90 V电泳90 min；转膜(400 mA，2.0 h)；洗膜(TBST洗5 min，2次；TBS洗10 min)；5%脱脂乳封闭，脱色；孵一抗(浓度1∶500～5 000)，4 ℃冰箱过夜；洗膜；孵二抗(浓度1∶5 000)过夜；洗膜；ECL发光(5～45 s)。图像采集处理，设β-actin为内参，用Image Pro Plus 6.0软件分别计算SynGAP和β-actin条带的灰度和面积之乘积，再分别计算出SynGAP与β-actin的比值，获得SynGAP相对含量。

2 结 果

2.1 水迷宫实验

2.1.1 各组大鼠逃避潜伏期比较 见表1。

由表1可见，第1～12次水迷宫实验，模型组、电针组大鼠逃避潜伏期均较空白组延长(P<0.05)；与模型组比较，第1次水迷宫实验，电针组逃避潜伏期较模型组延长，第2～7次较模型组缩短，但比较差异均无统计学意义(P>0.05)；第8～12次水迷宫实验，电针组大鼠逃避潜伏期均较模型组缩短(P<0.05)。

表1 各组大鼠逃避潜伏期比较

2.1.2 各组大鼠90 s内经过原平台所在区域次数比较 见表2。

表2 各组大鼠90 s内经过原平台所在区域次数比较 次，

由表2可见，模型组大鼠90 s内经过原平台所在区域次数少于空白组(P<0.05)；电针组大鼠90 s内经过原平台所在区域次数多于模型组(P<0.05)；电针组与空白组大鼠90 s内经过原平台所在区域次数比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组大鼠光镜下海马区脑组织大体形态结构 空白组大鼠海马区锥体细胞排列整齐，细胞间隙适当，细胞结构完整。模型组大鼠海马区锥体细胞层变薄、稀疏、排列紊乱，细胞间隙增大，细胞结构不完整，甚至有大量细胞缺失。与模型组相比，电针组大鼠海马区锥体细胞层增厚，神经元的萎缩、核固明显缩少。见封2，图1。

2.3 各组大鼠电镜下海马区脑组织超微结构 空白组大鼠海马CA1、CA3区神经元细胞核饱满，染色质均匀，胞核膜皱缩不明显；突触数量多，前膜内囊泡多，前后膜边界清楚，后膜致密物质厚，活性区长度长。模型组大鼠海马CA1、CA3区神经元细胞核有固缩，染色质不均匀；胞核膜明显皱缩；线粒体有肿胀、空泡；突触数量减少，前后膜边界不清、甚或融合，前膜内嚢泡减少、突触后膜致密物质稀疏，活性区长度较短。电针组海马CA1、CA3区神经元细胞核较为饱满，染色质均匀，胞核膜皱缩不明显；突触数量较多，前膜内囊泡较多，前后膜边界清楚，后膜致密物质较厚，活性区长度较长。见图2。

2.4 各组大鼠海马区脑组织SynGAP相对含量比较 见表3。

表3 各组大鼠海马区脑组织SynGAP相对含量比较

由表3可见，模型组大鼠海马区脑组织SynGAP相对含量低于空白组(P<0.05)；电针组大鼠海马区脑组织SynGAP相对含量高于模型组(P<0.05)；电针组与空白组大鼠海马区脑组织SynGAP相对含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠海马区脑组织SynGAP相对含量表达条带图见图3。

图3 各组大鼠海马区脑组织SynGAP相对含量表达条带图

2.5 各组大鼠海马CA1、CA3、DG区SynGAP的IOD比较 见表4。

表4 各组大鼠海马CA1、CA3、DG区SynGAP的IOD比较

由表4可见，模型组大鼠海马CA1、CA3、DG区SynGAP的IOD均低于空白组(P<0.05)；电针组大鼠海马CA3、DG区SynGAP的IOD均高于模型组(P<0.05)，CA1区则无统计学意义(P>0.05)；电针组与空白组大鼠海马CA1、CA3、DG区SynGAP的IOD比较差异均无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠海马CA1、CA3、DG区SynGAP表达见封2，图4。

图2 各组大鼠电镜下海马CA1、CA3区脑组织超微结构(×40 000)

3 讨 论

针刺治疗TBI后CD大鼠选用百会、人中、内关、后三里、绝骨穴，能醒脑开窍，调畅气机，疏通经络，有利于促进大鼠损伤脑组织的恢复[9-10]。本实验所选TBI动物模型制备方法稳定、可靠[11-12]。本研究深入研究TBI后CD的发生，故增加了水迷宫实验筛选[13]，结果证实模型组大鼠水迷宫实验逃避潜伏期延长，空间探索实验也表现较差。水迷宫实验是目前用于检验大鼠认知障碍特别是学习功能障碍的经典实验，本研究选择公认的逃避潜伏期、经过原平台所在区域次数作为观察指标[14-15]，结果发现，随着实验时间延长，各组大鼠逃避潜伏期时间均缩短，可能因为大鼠随着水迷宫实验次数增多、重复而表现能力越来越好[16-17]，或者水迷宫实验本身也是一种治疗方法，有利于大鼠认知功能恢复。本研究结果发现，电针对TBI后CD大鼠确实起到治疗作用，且随着治疗时间延长，效果更明显。

本研究观察发现，电针对TBI后CD大鼠海马光镜下大体形态和电镜下超微结构均具有一定改善作用。SynGAP在哺乳动物脑内突触后致密部高表达，有多个结构域，是多个信号通路中的关键蛋白之一。SynGAP上游受到N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)、钙调蛋白依赖蛋白激酶Ⅱ(CAMKⅡ)、细胞周期素依赖蛋白激酶5(CDK5)的调控，下游又调控小G蛋白等，同时也负调控α-氨基-3-羟基-4异恶唑-丙酸(AMPA)受体向兴奋性突触后面运输，参与各种病理生理机制，在改善智力低下、突触可塑性中发挥重要作用[18-19]。相关研究表明，SynGAP在海马区高度表达，并在神经可塑性变化及记忆形成中具有重要作用[20-21]。SynGAP通常是夹在支撑树突棘形成其结构的支架上，组织了大鼠肉瘤(Ras)蛋白化学信号链反应的启动，而后者是学习所需的信号通路。当钙离子(Ca2+)涌入突触后激活了CAMKⅡ，反过来将SynGAP从细胞支架处释放出来，进一步刺激Ras信号通路开始传递信号。SynGAP还通过与突触后致密蛋白95(PSD-95)、NMDAR受体结合，形成复合物，进一步调节细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)信号通路，ERK/MAPK信号通路参与调节学习记忆过程[22]。本研究中，应用Western Blot检测海马区脑组织SynGAP，发现电针组大鼠SynGAP相对含量较模型组明显上调。进一步免疫组化检测发现电针组能够上调CA3、DG区SynGAP的IOD，对CA1区上调不明显。

综上所述，电针治疗TBI后CD的机制可能是促进了神经元突触可塑性调节，进而调节了海马CA3、DG区SynGAP含量。本实验研究存在不足的地方：在电镜检测海马区脑组织超微结构时，只观察了海马CA1、CA3区，未观察海马DG区，下一步研究应更全面观察海马各个分区的超微结构；只研究了治疗结束时SynGAP表达变化，进一步可研究随治疗次数的SynGAP的动态变化。