木丹颗粒联合西医常规治疗早期糖尿病肾病临床疗效及对患者Toll样受体4/核因子κB、转化生长因子β1/Smad信号通路的影响

岳树香 甄云凤 霍丽梅

(河北省廊坊市人民医院药学部，河北 廊坊 065000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最常出现的微血管并发症之一，也是导致终末期肾病、肾衰竭甚至死亡的重要原因[1-2]。目前，西医主要采用降糖、降压、调脂、抗氧化、减少蛋白摄入等对症措施延缓DN进展，但其降低微量蛋白尿疗效有限，大部分患者肾功能仍持续减退，并发展为肾衰竭[3-4]。因此，寻找有效防治DN的药物是目前亟待解决的问题，这对于延长糖尿病患者生存期、改善预后至关重要。

木丹颗粒是用于治疗糖尿病周围神经病变的中药制剂，具有抗炎、抗氧化应激、改善血管内皮功能等作用，并且有研究显示其对糖尿病多种并发症也有一定治疗作用[5-6]。2017-05—2019-05，我们采用木丹颗粒治疗早期DN 45例，并与西医常规治疗45例对照，观察临床疗效及对患者Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)、转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad信号通路的影响，结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 全部90例均为河北省廊坊市人民医院(50例)和河北省人民医院(40例)内分泌科住院的早期DN患者，按照随机数字表法分为2组。观察组45例，男28例，女17例；年龄61～75岁，平均(63.84±8.23)岁；糖尿病病程6～18年，平均(8.57±0.99)年；DN病程2～8年，平均(3.64±0.47)年。对照组45例，男26例，女19例；年龄62～78岁，平均(64.02±8.62)岁；糖尿病病程7～19年，平均(8.70±1.03)年；DN病程1～9年，平均(3.59±0.45)年。2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 病例选择

1.2.1 诊断标准 西医诊断参照中华医学会糖尿病学分会微血管并发症学组制订的《糖尿病肾病防治专家共识(2014年版)》[7]。中医诊断参照中华中医药学会制订的《糖尿病肾病中医防治指南》[8]，辨证为气虚血瘀型。

1.2.2 纳入标准 ①符合以上中医、西医诊断标准，辨证为气虚血瘀型；②年龄>18岁；③患者均自愿入组，且签署知情同意书。

1.2.3 排除标准 ①年龄<18岁；②重要脏器功能障碍者；③合并急慢性感染、血液系统疾病、恶性肿瘤者；④其他原因导致的肾病或已经接受治疗者；⑤对本研究药物过敏者。

1.3 治疗方法

1.3.1 对照组 予常规西医治疗，包括降糖、降压、调脂、控制饮食、适量运动等。降糖药予盐酸二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H20023370)500 mg，日3次口服；降压药予缬沙坦胶囊(北京诺华制药有限公司，国药准字H20040217)80 mg，日1次口服。

1.3.2 观察组 在对照组治疗基础上加用木丹颗粒(辽宁奥达制药有限公司，国药准字Z20080033)7 g，日3次口服。

1.3.3 疗程 2组均治疗3个月。

1.4 观察指标 观察2组治疗前后空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、肾功能[血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、尿白蛋白排泄率(UAER)、肾小球滤过率(eGFR)]及外周血单核细胞(PBMCs)TLR4/NF-κB、TGF-β1/Smad信号通路关键因子mRNA的表达。标本采集：抽取患者空腹肘静脉血10 mL，置于2个乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中(5 mL/管)，一管常规离心后取血清，另一管采用Ficoll密度梯度离心法提取外周血PBMCs。采用全自动生化检测仪(日本日立公司，7600-020型)测定FPG，试剂由四川迈克生物科技有限公司提供；采用糖化血红蛋白测定仪(美国arkary公司，HA-8180型)及配套试剂测定HbA1c。肾功能检测：采用全自动生化检测仪(日本日立公司，7600-020型)测定血清Cr、BUN，试剂由四川迈克生物科技有限公司提供，并计算UAER、eGFR。PBMCs TLR4/NF-κB、TGF-β1/Smad信号通路关键因子mRNA表达：采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real time-PCR)测定PBMCs TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达。Trizol试剂盒提取PBMCs总RNA，参照逆转录试剂盒说明书合成cDNA第1链，引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。于荧光定量PCR仪(美国ABI公司，7500型)进行扩增反应，根据各样本测得的Ct值，设GAPDH为内参基因，以2-△△Ct表示各样本相对表达量，Trizol、逆转录试剂盒由日本Takara公司提供。引物序列如下：①TLR4：5'-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3'(正向)，5'-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3'(反向)；②MyD88：5'-ATTTGCACTCAGCCTCTCTCCA-3'(正向)，5'-CGAGTCCAGAACCAAGATTTGG-3'(反向)；③NF-κB：5'-AGGCGTCAAGGGATT-3'(正向)，5'-GCGTCCATCCATGATAC-3'(反向)；④TGF-β1：5'-ACACTCCAGCTGGGCTCTA GAGGGAAGCGC-3'(正向)，5'-ACA CTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3'(反向)；⑤Smad2：TACCACTCTCTCCCCTGTCAAT-3'(正向)，5'-GCAAACCTAAGCAGAACCTCTC-3'(反向)：⑥Smad3：5'-CCATCTCCTACTACGAGCTGAA-3'(正向)，5'-CACTGCTGCATTCCTGTTGAC-3'(反向)；⑦Smad7：5'-TTCCTCCGCTGAAACAGGG-3'(正向)，5'-CCTCCCAGTATGCCACCAC-3'(反向)；⑧GAPDH：5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'(正向)，5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'(反向)。

1.5 疗效标准 显效：中医临床症状基本消失，证候积分减少≥90%；有效：中医临床症状明显改善，证候积分减少70%～90%；无效：中医临床症状无改善甚至加重[9]。

2 结 果

2.1 2组治疗前后FPG、HbA1c比较 见表1。

表1 2组治疗前后FPG、HbA1c比较

由表1可见，治疗后2组FPG、HbA1c均较本组治疗前降低(P<0.05)，且观察组均低于对照组(P<0.05)。

2.2 2组治疗前后Cr、BUN、UAER及eGFR比较 见表2。

表2 2组治疗前后Cr、BUN、UAER及eGFR比较

由表2可见，治疗后2组Cr、BUN、UAER较本组治疗前均降低(P<0.05)，且观察组均低于对照组(P<0.05)；治疗后2组eGFR较本组治疗前均升高(P<0.05)，且观察组高于对照组(P<0.05)。

2.3 2组治疗前后PBMCs TLR4/NF-κB信号通路关键因子mRNA表达比较 见表3。

表3 2组治疗前后PBMCs TLR4/NF-κB信号通路关键因子mRNA表达比较

由表3可见，治疗后2组PBMCs TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达均较本组治疗前降低(P<0.05)，且观察组均低于对照组(P<0.05)。

2.4 2组治疗前后PBMCs TGF-β1/Smad信号通路关键因子mRNA表达比较 见表4。

表4 2组治疗前后PBMCs TGF-β1/Smad信号通路关键因子mRNA表达比较

由表4可见，治疗后2组PBMCs TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达均较本组治疗前降低(P<0.05)，Smad7 mRNA均升高(P<0.05)，且观察组改善均优于对照组(P<0.05)。

2.5 2组临床疗效比较 见表5。

表5 2组临床疗效比较 例

由表5可见，2组总有效率比较差异有统计学意义(P<0.05),观察组疗效优于对照组。

3 讨 论

近年来，全球糖尿病发病率高达20%～40%，而我国糖尿病发病率为10%，且呈逐年上升趋势，对人类健康造成严重威胁[10]。DN主要病理特征为肾小球基底膜增厚和细胞外基质累积，从而导致肾脏纤维化和肾小球滤过功能紊乱[11]。早期DN患者主要表现为微量白蛋白尿，随着疾病进展，肾功能持续恶化，从而出现大量白蛋白尿，若不能得到及时控制可进一步导致肾衰竭，甚至死亡。DN发病机制尚不明确，研究认为其发生发展与遗传因素、糖脂代谢紊乱、炎性反应、氧化应激、血管内皮功能损伤等因素均有关。其中长期高糖引起的糖代谢紊乱是肾脏病变的基础，高糖不仅引起肾脏血流动力学紊乱，还能够诱发炎性反应和氧化应激，这些因素均能损害肾脏血管内皮细胞，使内皮素-1(ET-1)等缩血管因子释放增多，而一氧化氮(NO)等舒血管因子合成减少，导致肾血管收缩痉挛和肾组织血流灌注减少，进一步加重肾损害。

目前，西医治疗DN主要采取对症治疗措施延缓疾病进展。缬沙坦属于血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)受体拮抗剂，能够竞争性阻断AngⅡ与血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1受体)结合控制血压，改善肾小球毛细血管滤过功能及减轻肾小球硬化，从而发挥肾脏保护作用[12]。但是，西医治疗DN虽然能够在一定程度上改善临床症状和肾功能，但对于炎性反应、肾纤维化的改善作用不理想，这可能是部分患者肾功能持续性减退最终发展为肾衰竭的重要原因。

DN属中医学“消渴病肾病”范畴，其病久可致气虚，气虚运血无力，导致血瘀内阻，脉络闭塞，属本虚标实、虚实夹杂之证。故治宜益气活血，通络止痛，标本兼治。木丹颗粒中黄芪甘温，补一身之气，补益脾胃，利水消肿，为君药；延胡索行气止痛，三七活血化瘀，为臣药，辅助君药活血化瘀，通络止痛；赤芍药、丹参、川芎、红花、苏木、鸡血藤为佐、使药，加强活血化瘀之功，使气行则血散。现代药理学研究表明，黄芪、丹参、赤芍、川芎等成分具有明显的抗炎、抗纤维化、减轻氧化应激、调解免疫、改善血流动力学等作用，对于治疗糖尿病及其慢性并发症具有较好疗效[13-15]。本研究结果显示，观察组临床疗效优于对照组(P<0.05)，说明在西医常规治疗基础上加用木丹颗粒辅助治疗早期DN疗效优于单纯西药治疗。

FPG、HbA1c是反映DN患者血糖控制效果的可靠指标；Cr、BUN、UAER、eGFR是评估肾功能的敏感指标。本研究结果显示，治疗后观察组FPG、HbA1c及Cr、BUN、UAER均低于对照组(P<0.05)，治疗后观察组eGFR高于对照组(P<0.05)，说明在西医常规治疗基础上加用木丹颗粒辅助治疗早期DN能够有效纠正糖代谢紊乱，从而改善肾功能。

TLR4是TLRs家族的重要成员，广泛分布于心脏、肝脏、肾脏等多种组织和细胞，与内源性或外源性配体结合后通过其接头蛋白MyD88结合，导致NF-κB的磷酸化和核转位，促进多种炎症因子分泌和肾组织损伤加重。研究证实，DN小鼠肾组织高表达TLR4、MyD88、NF-κB，且其水平与肾组织炎性反应程度具有正相关性，提示TLR4信号通路在炎性反应介导的肾组织损伤中发挥关键作用[16-17]。体外实验结果也证实，阻断TLR4信号通路的异常激活能够抑制嘌呤霉素氨基核苷诱导的DN足细胞损伤[18]。另外，TLR4炎症信号通路的激活也能够引起TGF-β1/Smad信号通路活化，后者与肾脏纤维化密切相关，二者相互影响，相互作用，共同导致DN进展。TGF-β1/Smad信号通路由TGF-β1、转化生长因子Ⅱ型受体(TGF-βRⅡ)及其受体底物Smad蛋白家族信号分子组成，后者主要包括Smad2、Smad3、Smad7，其中Smad2、Smad3是活化型受体，TGF-β1与细胞膜上的TGF-βRⅡ结合形成复合物后促进Smad2、Smad3磷酸化并转位到细胞核，从而调节与纤维化有关的基因表达；Smad7是抑制型受体，能够抑制TGF-β1/Smad信号通路的激活，减轻肾纤维化程度[19-20]。研究发现，DN大鼠肾组织Smad3表达上调，同时Smad7表达下调，药物能够通过调控TGF-β1/Smad信号通路改善肾纤维化[21-22]。以上研究提示，阻断TLR4/NF-κB、TGF-β1/Smad信号通路的激活进而抑制炎性反应和肾纤维化可能成为DN治疗的潜在靶点。本研究结果显示，治疗后观察组PBMCs TLR4、MyD88、NF-κB mRNA及TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达均低于对照组(P<0.05)，Smad7 mRNA高于对照组(P<0.05)，说明木丹颗粒辅助治疗早期DN通过抑制TLR4/NF-κB、TGF-β1/Smad信号通路的过度激活，从而降低与炎性反应和纤维化有关的细胞因子分泌，这可能是木丹颗粒发挥治疗作用的分子机制之一。

综上所述，木丹颗粒辅助治疗早期DN能够发挥肾脏保护作用，机制与抑制TLR4/NF-κB、TGF-β1/Smad信号通路，从而抑制炎性反应和纤维化有关。