20种茯苓菌株的亲缘关系分析△

金文松，刘文君，夏俊慧，李长乐，李赣新，都新荣，李佳欢，3，胡开辉，3*，张重义

1.福建农林大学 生命科学学院，福建 福州 350002；2.福建农林大学 农学院，福建 福州 350002；3.福建农林大学 菌业研究院，福建 古田 352200

目前茯苓菌核资源主要仍以人工椴木栽培获得，这种传统获取茯苓药用资源方式存在三方面问题：第一，以消耗大量林业资源为代价，使得菌林矛盾日益尖锐化；第二，生产模式易受生产环境的影响；第三，劳动密集型生产方式。前人研究结果表明茯苓菌核主要药效成分为茯苓三萜与茯苓多糖。应用茯苓菌丝液体发酵策略获取茯苓药用成分成为当前的一个研究热点。本课题组前期研究结果表明，16种菌株生长速度、生物量、胞内药效成分均具有一定的差异性，它们应属于不同的茯苓菌株[1]。基于当前发酵条件，基于当前发酵条件，遗传育种是获取菌丝生物量高、胞内药效成分含量高的优质发酵出发菌株的一条途径，尽管当前茯苓性模式与生活史还存在较大的争议[2-4]。

明确各菌株之间的亲缘关系远近是遗传育种成功的基本条件之一。DNA分子标记因其稳定性好、实验成本低、操作容易等优点，被广泛用于种质资源研究、遗传图谱构建、基因标记、遗传多样性分析、系统发育分析、辅助育种等研究工作[5]。在茯苓菌株亲缘关系鉴定方面，Interanl Trasncribed Spacer(ITS)序列分析、28S rRNA序列分析[6-8]、Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD)标记[9-10]、Sequence-related Amplified Polymorphism(SRAP)标记[11]、Simple Sequence Repeats(SSR)标记[12]均有被用于茯苓菌株间遗传关系分析的报道。简单重复序列间扩增(ISSR)标记是基于SSR标记发展来的分子标记技术[13]，已被更广泛应用于茯苓菌株种质资源分析领域[14-16]，鉴定其他中药亲缘关系[17-20]。鉴于2009年中国已将ISSR标记作为食用菌菌种鉴定行业标准[21]，笔者应用ISSR标记分析20种茯苓菌株的遗传关系，并应用体细胞不亲和性实验对ISSR标记分析结果予以验证，以期明确20种茯苓菌株之间的遗传亲缘关系。研究结果为将来应用遗传育种方法获取茯苓优质液体发酵菌株提供理论依据。

1 材料

1.1 试药

1.1.1茯苓菌株收集 本项目共收集到20种茯苓菌株，菌株编号、俗名及来源相关信息见表1。

1.1.2试剂 2 x HieffTMPCR Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司)，CTAB(MYM biological technology company)，RNAase(北京宝生物科技有限公司)，有机试剂、无机盐等(国药控股集团有限公司)。

表1 茯苓菌株收集信息

1.1.3ISSR引物 本研究所用ISSR引物序列根据来源分为两大类，第一类引物由加拿大哥伦比亚大学设计的UBC primer set #9 (Microsatellite)，共100条引物；第二类引物参考行业标准NY/T 1730-2009[21]，共128条引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。经优化的聚合酶链式反应(PCR)体系筛选之后，共20条引物用于本研究ISSR标记分析，具体引物信息、退火温度、扩增条带数与多态性条带数见表2。

表2 ISSR引物退火温度与茯苓菌株的条带多态性

1.2 仪器

ETC811梯度PCR仪(东胜创新生物科技有限公司)，JS-2012凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司)，JS-HE128水平电泳仪(上海培清科技有限公司)，JS-power 600电泳仪电源(上海培清科技有限公司)，3K15高速冷冻离心机(德国Sigma公司)，SPX-250B-Z生化培养箱(上海博迅实业有限公司)，Nonodrop 2000(美国Thermo Fisher公司)。

2 方法

2.1 茯苓菌丝体培养与基因组DNA提取

菌丝体培养基配方、培养与收集参照参考文献[1]。采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取茯苓基因组DNA，操作步骤如下：应用液氮将菌丝研磨成粉，转入1.5 mL离心管，加入500 μL 65 ℃预热的2% CATB(100 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0，20 mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA)，1.4 mol·L-1NaCl，2% CTAB，2%聚乙烯吡咯烧酮)水浴60 min，加入等体积三氯甲烷/异戊醇(24∶1)抽提，10 000 r·min-1离心10 min(离心半径为8.5 cm)，转移上清至新管，并加入RNAase A(40 μg·mL-1)于37 ℃消化2 h，加入0.7倍体积预冷异丙醇于-20 ℃沉淀DNA，离心收集DNA，并用70%乙醇洗涤2次，最后溶于去离子水。应用Nanodrop测定DNA浓度，-20 ℃保存备用。

2.2 ISSR分析

PCR反应体系：2 x HieffTMPCR Master Mix 10 μL，引物 10 μmmol·L-1，DNA 100 ng，去离子水补齐至20 μL。PCR扩增程序：95 ℃，300 s，1个循环；95 ℃，30 s，退火温度(见表2)，30 s，72 ℃，120 s，35个循环；72 ℃，600 s，1个循环；4 ℃，程序结束。电泳：琼脂糖凝胶(1.5%)，1% DNA Green，胶长20 cm，恒压120 V。染料电泳到胶末端，拍照记录。

2.3 数据统计与聚类作图

ISSR-PCR获得的DNA图谱带型用0、1统计，并据此建立DNA条带位置数据库。相同的迁移位置存在条带的标记为1，不存在条带的记为0。遗传相似系数按公式(1)计算：

Gs=2Nij/(Ni+Nj)

(1)

其中Nij表示基因型间共有带数目，Ni和Nj表示量基因型各自的条带数目。

遗传距离按公式(2)计算;

Gd=1-Gs

(2)

聚类分析方法为UPGMA，并使用NTSYSpc-2.10e软件进行聚类并绘制聚类树状图。

2.4 体细胞不亲和性分析

根据ISSR标记结果，选择不同遗传相似系数的9种菌株进行体细胞不亲和性实验。将待检验菌株的菌丝接种在固体马铃薯萄葡糖琼脂(PDA)加富平板上，每个平板接种2种不同菌株。将接种好的平板放在26 ℃恒温培养箱中培养，观察菌株间是否会出现拮抗线，拍照并做记录。

3 结果

3.1 20个茯苓菌株基因组DNA提取与检测

应用CTAB法分别提取20种茯苓菌株的基因组DNA(见表1)，测定其浓度并对其质量进行检测。Nanodrop测定结果表明，20种菌株基因组DNA的质量浓度为100～500 ng·μL-1，A260～280 nm均在1.80左右，表明所提取的基因组DNA纯度较好。应用琼脂糖凝胶电泳法对所提取的20种菌株基因组DNA进行检测，电泳结果见图1，各菌株主带明显，无弥散条带，条带大小较为一致，表明提取的DNA比较完整，DNA没有降解和断裂，可用于后续ISSR-PCR分析。

图1 20种茯苓菌株基因组DNA电泳图

3.2 ISSR标记引物筛选

本研究根据加拿大哥伦比亚大学设计的英属哥伦比亚大学(UBC)引物序列与食用菌菌种真实性鉴定-ISSR法所提供的引物序列，共合成了128条ISSR引物。首先对PCR反应体系、扩增程序及电泳条件作了初步的优化，优化标准为PCR条带明亮清晰，PCR条带在琼脂糖凝胶上具有较好的分离度，优化结果见2.2。随机选择Y1菌株基因组DNA作为筛选ISSR-PCR引物的模板，发现其中62条引物可扩增出条带，68条引物几乎无扩增条带(数据未显示)，从62条可扩增出条带引物中筛选出具有较好扩增图谱的20条引物作为本实验构建ISSR指纹图谱的引物(见表2)。采用梯度PCR条件，以Y1基因组DNA作为模板，分别分析20条引物的较适退火温度，退火温度为35.0～50.6 ℃(见表2)。

3.3 20种茯苓菌株的ISSR指纹图谱分析

为了明确20种茯苓菌株之间的亲缘关系，本研究应用已筛选出的20条ISSR-PCR引物对提取的20种茯苓菌株基因组DNA分别进行PCR扩增。分别对ISSR-PCR电泳结果进行琼脂糖凝胶电泳分析，并拍照与记录。电泳结果显示，大部分引物都可以在样品基因组DNA上成功扩增出条带，但部分引物不能从L菌株DNA上扩增出条带(数据未显示)。对所有的电泳图片进行DNA条带进行统计，并分析DNA带型。统计结果显示，20条引物在20种菌株基因组DNA上共扩增出241条条带，其中特异性条带89条(见表2)，代表性ISSR-PCR图谱见图2。

注：A.引物P19;B.引物UBC830;C.引物P22;D.引物UBC850。图2 20种茯苓菌株的ISSR图谱

3.4 20种茯苓菌株的聚类分析

对241个标记条带进行统计，生成20种茯苓菌株的遗传数据库，构建它们的遗传相似系数矩阵。采用NTSYS软件进行聚类分析，绘制菌株的ISSR聚类树状图(见图3)。聚类分析结果表明，在36%相似系数时，20个菌株可分为两大类，L独处一类；在94%相似系数时，除了无法区分AS 5.137与GIM 5.219之外，其余菌株均被明显区别开。

3.5 体细胞不亲和性分析

体细胞不亲和性指2种菌株之间的亲缘关系较远时，在它们菌丝交接处会产生特异性的拮抗反应，彼此防止自身遗传物质被外来DNA改变，从而产生肉眼可分辨的拮抗线。从本质上讲，因菌株产生代谢产物，如分泌酶系、次级代谢产物等非遗传物质，介导菌株之间的不亲和性，体细胞不亲和性标记实质为一种细胞标记，是一种传统用于初步鉴定真菌亲和性关系的标记。本研究中，为明确L与其他菌株之间的遗传关系，选取与L遗传相似系数26%～59%的4种菌株分别进行体细胞不亲性分析，实验结果表明，L均与测试菌株之间产生较弱拮抗线。选取遗传相似系数29%～94%的6种菌株进行体细胞不亲和性分析，体细胞不亲和性实验结果显示，除GIM 5.219与L之间未产生拮抗线之外，其余两两对峙培养的菌株之间均产生较弱，肉眼可分辨的拮抗线(见图4)。

图3 20种茯苓菌株的亲缘关系

注：A.L与4种茯苓菌株之间体细胞不亲和性分析结果；B.6种茯苓菌株之间体细胞不亲和性分析结果。图4 9种茯苓菌株间体细胞不亲和性分析结果

4 讨论

ISSR分析结果的可靠性取决于供试引物数量，供试引物越多，ISSR分析结果的可靠性与可信度越高。本研究共合成了128条ISSR引物，从中筛选出20条引物用于ISSR-PCR分析，尽可能地保证ISSR分析结果的可靠性。其次，笔者尝试用不同长度的琼脂糖凝胶对PCR产物进行分离，发现凝胶长度对PCR条带的分离度具有较大影响，胶越长，PCR条带间的分离度越高，在本研究中，笔者使用20 cm长度的琼脂胶，使PCR扩增条带的可读性得到一定程度的提高。

本研究ISSR-PCR扩增条带的琼脂糖凝胶电泳结果显示，大部分菌株之间的扩增条带较为一致，多态性条带比例为20%～55%。除了菌株L与其余菌株的遗传相似系数较小之外，其余19种菌株的遗传相似系数均在68%以上，反映20种茯苓菌株之间的亲缘关系较近。这与同行所得到的我国茯苓种质资源遗传背景较窄结论相一致[6，9-12，16]。

笔者前期的研究结果表明，对于菌丝产胞内多糖而言，DB菌丝生物量最高，AS 5.137菌丝胞内多糖含量最高；对于菌丝产胞内三萜而言，SC菌丝生物量最高，Y1菌丝胞内三萜含量最高[1]，是否可以通过遗传育种方法获得遗传稳定、生物量与产胞内多糖或三萜含量均高的优质发酵出发菌株，是今后值得去研究的方向。

体细胞不亲和性分析作为一种传统的菌种鉴定技术，常被用于菌种之间的亲缘关系鉴定。结合本研究ISSR标记分析结果，笔者选取遗传相似系数为26%～94%的9种菌株进行体细胞不亲和性分析。大部分菌株之间具有较弱的拮抗性，表明测试菌株之间存在一定的差异性。尽管在ISSR分析中，L菌株与GIM 5.219存在明显的遗传距离，但该2种菌株并未表现出体细胞不亲和性行为。结果表明体细胞不亲和性分析结果并不能完合吻合ISSR标记结果。此外，实验结果也表明菌株之间的拮抗强度与ISSR标记分析得到的遗传相似度不具有显著的正相关关系，这与应用体细胞不亲和性标记与RAPD标记分析糙皮侧耳品种的遗传关系结论相类似[22]。

本研究结果表明ISSR标记可作为鉴定茯苓菌株之间亲缘关系的一种DNA分子标记技术，ISSR分析结果表明笔者收集的20种茯苓菌株，其中19种茯苓菌株遗传关系较近，反映测试的茯苓种质资源遗传背景较窄。