基于柠檬酸体系的中药电化学指纹图谱的应用研究△

杜宝中，王昊阳，樊花，余中，刘广钧

西安理工大学 应用化学系，陕西 西安 710054

中药以其纯天然性、毒副作用低、标本皆治等特点，数千年来为中华民族的健康和繁衍做出了巨大贡献，被誉为中华民族的宝贵文化遗产;但因中药组成的复杂性及药效的多组分协同效应，导致其质量的一致性和临床疗效的稳定性受到较大影响，从而成为制约中药的现代化进程和“铺轨”国际市场关键所在。因此，如何根据中药的特点，对其化学成分及含量、作用机制进行研究，形成具有中医药特点的现代质量标准，已成为实现中药标准化、现代化和国际化的一项重要课题。

目前，中药的鉴别和质量控制的方法主要有：1)色谱法[1-2]，研究和应用最广泛的方法，气相色谱法仅适用于分离、鉴别和分析其中挥发性成分，而高效液相色谱仅用于真溶液体系，需要复杂的前处理，使得药物有效信息丢失，两者均不能体现中药的完整信息；2)波谱法[3-4]，紫外吸收光谱主要用于中药中所含的不饱和组分，红外光谱与拉曼光谱也只能给出中药的部分结构或所含官能团的信息，即图谱难以全面反映中药的特性和协同作用，核磁共振被认为是研究中药有效成分化学结构的重要方法之一，但其制样手续繁杂、测试成本高，同样也仅为部分结构信息；3)DNA分子标记技术[5-6]，该法可靠性强，重现性好，具有专属性，但操作要求苛刻、仪器设备昂贵，还需引物筛选、标记、序列测定等，难以推广普及。上述方法的应用范围各有不可忽视的局限性，因此探索简便、快速、高效的指纹图谱新方法，以适应对中药材的鉴别与质量控制，无疑是摆在分析工作者面前富有挑战性的任务之一。

基于指纹图谱技术建立的中药质量控制体系应从其整体作用不同于化学药的特点出发，实现对多组分构成的复杂体系的中药全成分的有效分析，才能真正达到中药的鉴别及质量控制，确保用药安全、疗效稳定[7]。

利用电化学方法与振荡体系，获取能显示中药特性的振荡图谱，并由图谱反映的信息鉴别中药种类和确定化学成分的量。方法灵敏、选择性高、简便可靠，已引起了高度重视[8-9]。本研究基于B-Z化学振荡反应原理，构建了KBrO3-Ce(SO4)2-H2SO4-柠檬酸振荡体系，通过对空白体系稳定性和重现性的考察与组成优化，用于27种中药的电化学指纹图谱的检测，以及黄芪、枸杞子、白术道地性的鉴别，中药形态和不同部位差异的区分等。结果表明，图谱特异性显著，信息丰富，可用于中药的质量评价，道地性、真伪的鉴别及定量分析；同时也是对于色谱和波谱指纹图谱技术的补充与拓展。

1 材料与方法

1.1 材料

CHI660b电化学工作站(上海辰华仪器公司)，17型双液接饱和甘汞电极、213型铂电极(上海精密科学仪器有限公司)，150 mL反应器(天津玻璃仪器厂)。

陈皮(四川)、五加皮(陕西)、西洋参(陕西)、川贝母(四川)、丹参(陕西)、川芎(四川)、杜仲(甘肃)、茯苓(河南)、葛根(广西)、黄柏(四川)、肉桂(云南)、桑叶(陕西)、山楂(山东)等中药材为市售，并经陕西省食品药品检验研究院中药室主任罗定强高级工程师鉴定为正品。硫酸高铈、柠檬酸、氯化钾、硝酸钾、溴酸钾、硫酸均为分析纯，所有溶液用二次蒸馏水配制。

1.2 操作方法

以铂电极为工作电极，双液接饱和甘汞电极为参比电极。控制水浴温度(37±1)℃，分别向反应器中加入1.00 g干燥的中药粉末(粒径<0.15 mm)、45 mL H2SO4溶液，搅拌下浸出15 min，再依次加入硫酸高铈、柠檬酸，待基线稳定，最后加入5 mL KBrO3溶液，同时采集数据，记录E-t振荡曲线至电位振荡消失。即获得中药非线性电化学指纹图谱。

2 结果与讨论

2.1 电化学指纹图谱

根据化学振荡原理，酸性条件下，BrO3-为氧化剂，柠檬酸为振荡底物，硫酸高铈为催化剂[10]，而反应中生成具有自催化作用的HBrO2，其存在与否将直接导致BrO3-的还原产物Br-的形成和Ce4+→Ce3+的进行；当Br-累积与Ce4+消耗至临界值时，将导致振荡反应发生，表现为体系的氧化还原电位值随时间呈周期性变化[11]。随着有机底物柠檬酸的耗散，振荡最终停止。电化学指纹图谱中指纹峰的含义区别于色谱峰，色谱峰仅代表经色谱柱分离样品后，单一组分随保留时间的检测结果，且不涉及任何化学反应，而振荡波形的指纹峰则代表振荡组分与底物反应随时间的非线性变化，在振荡图谱中，1个指纹峰代表振荡反应的1个周期。因此，电化学指纹图谱可提供完整的定性及定量化学信息。

中药为多组分复杂体系，其药效为多种活性或非活性成分协同作用或“生克作用”。如以中药为振荡底物，固定振荡体系各组分浓度，由于每种中药参与振荡反应的物质不同，对振荡体系的扰动方式和程度亦不相同(表现为对振荡反应的抑制或增强)。因此，利用这一规律可得到每种中药的特征振荡图谱，从而实现对中药的真伪鉴别及质量评价。

2.2 空白体系稳定性

中药电化学指纹图谱是其对空白振荡体系的扰动而形成，叠加于空白振荡图谱之上。因此空白振荡体系的稳定性是获取准确结果的前提。本研究以诱导期(t0)、振荡期(td)、最大振幅(Amax)、振荡周期(T)、最高电位(Emax)、起始电位(Emin)、平衡电位(Ea)为考察指标，平行测定3次，其振荡图谱和参数分别见图1和表1。表1中7组参数RSD≤1.63%，因此空白振荡体系具有良好的稳定性和重现性。

图1 空白体系的振荡图谱

2.3 振荡体系与测试条件

基于振荡图谱的7个特征参数，以振荡波形特征显著、信息完整、诱导期较短，振荡期适中为依据，分别探讨了体系各组分浓度、温度、搅拌速率及中药加入量对振荡图谱特征性的影响。经优化确定振荡体系组成为：0.04 mol·L-1KBrO3、0.01 mol·L-1Ce(SO4)2、0.55 mol·L-1H2SO4、0.01 mol·L-1柠檬酸；检测条件：温度(37±1)℃，搅拌速率100 r·min-1，浸出时间15 min，中药加入量1.0 g·(50 mL)-1。获得稳定、重现的电化学指纹图谱。

2.4 图谱重现性

中药指纹图谱的特征之一，即重现性，也是其是否具有通用性和实用性的衡量标准。在确定的振荡器及检测条件下，获取陈皮的电化学指纹图谱，测定3次，考察其重现性，结果见表2。

如表2所示，陈皮电化学指纹图谱7个参数的RSD≤2.61%，说明在相同测试条件下，同一中药的振荡图谱具有较好的重现性。

2.5 图谱特异性

在确定的振荡体系和测试条件下，分别以黄芪、陈皮、白芍等27种中药为振荡底物，获得形状迥异的振荡特征图谱，见图2。

图2的振荡图谱波形各异，表现出因不同种类的中药其化学成分不同而具有的个性特征，即特征参数存在显著差异。因此，利用振荡图谱对中药进行真伪辨识和质量评价是一种科学、有效的新方法。此法与色谱指纹图谱相比，样品无需预处理、操作简单、检测时间短，并且能够给出中药的群集信息，是一种有效的中药鉴别手段和质量评价方法。

2.6 药材道地性鉴别

道地药材系指质优效佳，源于中医药临床实践，与自然条件和生态环境密切相关，是中药学中控制药材质量的一项独具特色的综合判别标准。目前，主要以经验判断或基源(DNA指纹图谱)检测等方法[7]，前者缺乏科学性，而后者检测手续繁杂、条件苛刻、成本高。为此，笔者以本研究所建立的振荡体系对不同产地的白术、枸杞子和黄芪进行了检测，获得电化学指纹图谱见图3～4。

如图3和图4所示，不同源的同种中药材的电化学指纹图谱形状相似，说明这些中药对振荡反应机理产生影响的化学成分相同，但Amax、Emin、T等有明显差异。

表1 空白体系电化学指纹图谱的稳定性

表2 陈皮电化学指纹图谱的重现性

图2 不同中药的电化学指纹图谱

图3 不同产地中药的电化学指纹图谱

图4 不同产地黄芪的电化学指纹图谱

这些差异表明，尽管同种药材所含活性成分的种类大致相同，但由于其生长的自然环境、耕种方式及采收季节等不同，导致不同地域的同种中药活性成分含量存有差异，即定量信息之间存在明显差异，从而对振荡体系的扰动程度不同。因此，图谱的特征参数存在差异。依此可见，电化学指纹图谱用于中药道地性的鉴别，科学、简便、直观。

2.7 中药的质量评价

中药振荡图谱的波形及内涵的特征参数，不仅与中药所含化学成分的种类有关，还受到其含量多少的影响。在应用指纹图谱技术对不同源的同种中药进行质量评价时，要求其定性和定量信息之间均存在明显差异。实验测定了不同加入量黄芪的电化学指纹图谱，在一定的检测用量范围内，考察定量信息与总活性成分含量的关系[12]。实验发现，其td与m呈良好的线性关系(td=-2695m+7844，r=0.987)，线性范围1.0～1.5 g。

分别测试1.0 g内蒙古、甘肃、陕西黄芪的电化学指纹图谱(见图4)，根据黄芪指纹图谱td与m的关系，若以内蒙黄芪总活性成分为1，则陕西和甘肃黄芪的总活性成分分别为0.962 8、0.860 3。即总活性成分含量：内蒙古>陕西>甘肃，符合黄芪道地以“北芪最佳”的说法。在临床应用中，3个产地的黄芪达到同一疗效的用药当量关系为：

内蒙古(1.000 g)=陕西(1.039 g)=甘肃(1.162 g)

2.8 不同部位中药振荡图谱

中药不同部位的化学成分及其含量存有差异，因此其各自的功效和药用价值不同。如全当归既能补血、又可活血，当归尾则为破血，而当归身偏补血和养血之功效。迄今，对同一中药不同部位的振荡图谱鉴别尚未见到相关的报道。为此，分别测试了全当归、当归尾和当归身的电化学指纹图谱，见图5。

图5 当归不同部位电化学指纹图谱

由图5可以看出，不同部位的当归其指纹谱图存在明显差异，说明不同部位的当归含有的有效成分和含量存在差别，对振荡体系的扰动作用不同。因此，此法对同种中药的不同部位可进行有效区分与评价，亦可为全药材资源的综合利用提供一定的科学依据。

2.9 中药复方的指纹图谱

中药复方是指由2味或2味以上药味的药效相似或相近的中药配伍，即所谓“相生”，是中医方剂的主体组成部分。如茯苓的功效为利水渗湿、益脾和胃、宁心安神等，黄芪具有补气生津、保肝、利尿等功效，故两者可配伍使用；当归与川芎均具有活血行气、调经止痛的作用，可配伍使用。为此，检测了2种复方中药的电化学指纹图谱(见图6～7)。

图6 黄芪+茯苓的电化学指纹图谱

图7 当归+川芎的电化学指纹图谱

图6～7显示，复方中药的指纹图谱与单味中药的图谱存在明显差异，具有其特征性。这可能是由于复配后活性成分的协同作用对有机底物的扰动作用与单味中药的活性成分存有差异，即对振荡体系的扰动发生了改变。此为鉴别同药效不同组方提供了一种可行的手段。

2.10 不同形态中药指纹图谱

中药通常以水剂、散剂、丸剂等形态服用，实践表明，中药的形态与治疗之间有着密切关联。故选择正确的形态服用，能充分发挥中药的药性及其临床疗效。为此，实验对不同剂型陈皮的电化学指纹图谱进行对比分析(见图8)。

图8 不同形态陈皮的电化学指纹图谱

由图8可以看出，同种药材因所含活性成分相同而具有相似的指纹图谱，但形态不同其图谱间又存在明显差异，对比空白振荡体系可知，陈皮为抑制作用。图8中陈皮汁的振幅Amax最小，抑制作用最强，振荡期td长，药效持续，即熬制使得中药有效成分充分溶出。验证了传统服用中药的正确性。

2.11 振荡反应机理

振荡反应通常分为能量积累、能量平衡、能量消耗3个阶段，而温度对各阶段产生的影响不同。结果表明，反应速率随着温度的升高而加快，使得诱导期和振荡期明显缩短。由ln(1/t0)～T-1和ln(1/t)～T-1关系及Arrhenius式，可求得诱导期和振荡期反应的活化能分别为58.2、67.7 J·mol-1，表明两者反应机理不同。即振荡反应包含诱导反应和振荡反应2个历程，诱导反应为振荡反应积蓄能量，以使体系具有能够发生振荡反应的氧化还原电势(φ氧化/φ还原>1.0 V，相较于饱和甘汞电极)，两者存在因果关系。

中药的有效成分主要包含有多糖、皂苷、黄酮、生物碱、有机酸及微量元素等，化学成分十分复杂，少则数种，多者可达近百种。因此，本研究仅以参类药材中常见的人参皂苷Rh2为例，推测其与振荡体系的反应机理。

人参皂苷Rh2含有多个醇羟基、1个葡萄糖环和1个双键，具有一定的还原性，且羟基可与酸发生酯化反应；在体系的催化作用下，可将醇羟基氧化成羰基[13]。根据B-Z振荡理论推测机理如下：

过程1)：Br-离子被氧化为HOBr

过程2)：BrO3-被还原为HOBr2

过程3)：Br-和Ce3+的再生

为了验证振荡机理和中药对振荡参数的扰动，利用Br-选择性电极在线监测空白和加药后振荡器中c(Br-)的变化(见图9～10)。图9显示，在空白振荡体系中，c(Br-)的变化呈典型的B-Z化学振荡特征，表明c(Br-)是振荡反应发生的关键因素，控制着反应的进程和振荡的循环过程。图10表明，中药的化学成分(人参皂苷Rh2)与Ce(SO4)2等发生反应，改变了振荡组分的浓度，导致振荡图谱特征参数发生变化。在振荡停止后空白体系c(Br-)逐渐升高，加药体系则逐渐减小，推测是由于加入中药发生化学反应所致。

图9 空白振荡体系的Br-振荡图谱

图10 加药振荡体系的Br-振荡图谱

另外，采用循环伏安法测定了人参在该振荡器中的循环伏安图。结果表明，随着人参加入量的增加，氧化峰电流值逐渐减小(见图11)，且与氧化峰电流呈良好的线性关系，r=0.991，说明人参中化学成分(人参皂苷Rh2)参与体系的振荡反应，改变了振荡器组分的浓度，由此也佐证了2.7所得td～m关系的正确性。

图11 不同加药量的循环伏安图

3 结论

非线性电化学指纹图谱既体现了中药“君臣佐使、升降浮沉”的群集信息，又反映了不同中药之间“相生相克”的协同效应，亦体现了以“整体性”和“模糊性”为显著特证评价中药材质量的要求。因此，可广泛用于中药的真伪识别、道地性鉴定以及质量的定性定量评价。

本研究建立KBrO3-Ce(SO4)2-H2SO4-柠檬酸振荡体系及其最佳测试条件：0.04 mol·L-1KBrO3、0.01 mol·L-1Ce(SO4)2、0.55 mol·L-1H2SO4、0.01 mol·L-1柠檬酸，温度(37±1)℃、搅拌速率100 r·min-1、浸出时间 15 min、中药加入量1.0 g·(50 mL)-1。图谱稳定重现、直观明了、特异性显著；方法简便、快速、灵敏、有效，无需预处理试样，具有推广价值。