HPLC法测定不同年生野山参中9种人参皂苷含量

杨怀雷，查 琳，王 影，徐芳菲，李 蕾，曹志强*

（吉林人参研究院·吉林通化·134001）

人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey的干燥根。以生态不同区分为野山参、移山参和园参[1]，在山野天然生长者被称为野山参。野山参是我国传统的名贵中药材，其药用历史源远流长，具有大补元气、生津、益肺、安神等功效[2]。现代药理学研究表明人参皂苷是其主要活性成分，故野山参中人参皂苷的含量可作为评价其内在质量的重要指标之一。近年来，对于野山参的研究主要集中在鉴别、培育、指纹图谱等方面[3～7]，对其人参皂苷含量研究较少[8]。本文采用高效液相色谱法对不同年生野山参中的9种人参单体皂苷成分进行测定，为野山参的基础成分研究提供了参考依据，可用于野山参的质量评价和质量控制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪（Ultimate 3000），美国赛默飞有限公司；电热恒温水浴锅（HH-6），金坛市白塔金昌实验仪器厂；电子天平（SQP），赛多利斯科学仪器有限公司。

1.2 材料

野山参(5～18 年生)；人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3和 Rd 标准品均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯（Fisher，USA），甲醇和正丁醇为分析纯（北京化工厂）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3、Rd 对照品适量， 制成人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3、Rd 对 照 品 浓 度 分 别 为 0.1185、0.1290、0.1090、0.1160、0.1580、0.1160、0.1070、0.1345、0.1055 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取不同年生野山参于烘箱中（65℃）烘干，粉碎，过80目筛。精密称取野山参粉末 （5～18年）0.5g，加10mL（20倍量）75%乙醇加热回流2h，重复提取3次，合并滤液，蒸干。残渣加10mL水溶解并转移至分液漏斗中，再加10mL水饱和正丁醇萃取，重复萃取5次，合并正丁醇萃取液，蒸干。残渣加甲醇溶解并转移至2mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件

色谱柱为Thermo BDS HypersiL C18柱 (250 mm× 4.6 mm，5μm)，流动相为乙腈-水（A-B），梯度洗脱，0～30 min(19%A)，30～35 min(19% ～24%A)，35～40 min(24%A)，40～55 min(24% ～28%A)，55～110 min(28% ～29%A)，110～130 min(29%～ 33%A)，110 ～ 130 min(29% ～ 33%A)，110 ～ 130 min(29% ～33%A)；流速为1.0mL/min；检测波长为203 nm；柱温为40℃；进样量为5μL。

2.4 测定

精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品色谱图中，在与对照品色谱峰相应的位置上，显示出保留时间相同的色谱峰，结果见图1。

图1 混合对照品（A）和供试品（B）色谱图

Rg1；2.Re；3.Rf；4.Rb1；5.Rc；6.F1；7.Rb2；8.Rb3；9.Rd

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系

精密称取人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3、Rd 对照品适量， 制成人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3、Rd 对 照 品 浓 度 分 别 为 1.0258、1.0473、0.3047、2.5086、1.0921、1.0546、0.8282、0.1391、0.2084 mg/mL的混合对照品溶液。精密吸取混合对照品溶液 0.5、1.0，2.0、3.0、4.0、5.0mL 分别置于 5 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，配制出不同浓度的混合对照品溶液（1-6号）备用。精密吸取1号混合对照品溶液0.5ml置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得7号混合对照品溶液。分别精确吸取1-7号各浓度的混合对照品溶液5μL，注入液相色谱仪进行测定，记录峰面积。以各标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做回归曲线，得到人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 回归方程，详见表 1。

表1 回归方程

结果表明，各对照品回归方程的相关系数均不小于 0.9995， 人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3和 Rd分别在 0.1026～1.0258 mg/mL、0.1047～1.0473 mg/mL、0.0305 ～ 0.3047 mg/mL、0.2509 ～2.5086 mg/mL、0.1092 ～ 1.0921mg/mL、 0.0105 ～1.0546 mg/mL、0.0828 ～ 0.8282 mg/mL、0.0139 ～0.1391mg/mL和0.0208～0.2084mg/mL范围内线性关系良好。

2.5.2 精密度实验

精密吸取混合对照品溶液5μL，重复进样6次，记录峰面积。 测得人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3和Rd峰面积的RSD （n=6） 分别为 0.76%、0.87%、0.96%、1.03%、0.98%、1.19%、0.58%、0.83%和1.37%，表明此方法精密度良好。

2.5.3 稳定性实验

精密吸取供试品溶液 5μL， 分别于 0、2、4、8、12和 24 h 进样，记录峰面积。人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3和 Rd 峰面积的 RSD 分别为 0.67%、0.92%、1.07%、0.51%、0.79%、1.26%、0.82%、1.49%和1.25 %，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.4 重复性实验

取5年生野山参样品6份，精密称定，按照“2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份。精密吸取供试品溶液5μL进样，分别进行测定。结果表明，人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3和 Rd 的含量平均值分 别 为 1.8546、2.0628、0.5849、3.5011、1.5447、0.4482、1.1539、0.2006 和 0.5494mg/g，RSD 值 分 别1.19%、1.02%、0.95%、1.42%、1.81%、1.77%、1.69%、1.91%和1.36%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率实验

分别称取已知含量的5年生野山参样品粉末6份，每份0.25 g，每份分别加入适量人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3和 Rd 对照品溶液，按照“2.2”项下方法进行制备，并按照“2.3”项下色谱条件进样分析，计算回收率。 结果（表 2）人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3和 Rd 对照品的平均回收率 （n=6） 分别为 98.08%、97.80%、96.80%、98.93%、99.22%、96.29%、98.01%、96.48%和98.95%。回收率的RSD值分别为 0.80%、0.76%、0.78%、0.62%、0.99%、0.89%、1.27%、1.10%和1.18%。实验结果表明，各测定组分的平均加样回收率均在95%～105%之间，加样回收率良好。

表2 回收率实验结果

2.6 样品含量测定

分别取5～18年生野山参样品，精密称定，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液5μL，分别按照“2.3”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，并根据外标法计算各组分的含量，结果见表3。

表3 含量测定结果（mg/g）

3 讨论

本文比较了甲醇-水、乙腈-水和乙腈-磷酸-水流动相体系，乙腈-水的分离效果最好。而加入磷酸对供试品中人参皂苷整体的分离度及峰形没有显著改善，且增加了色谱柱清洗难度，故最终确定乙腈-水为最佳流动相体系。本实验采用一种梯度洗脱色谱条件实现了野山参中9种人参单体皂苷成分的同时测定，与文献方法相比[9～10]，分离时间短，分离度良好，检测效率高。

本实验采用不同提取方法，超声法和回流法对样品中皂苷类成分进行提取，结果显示回流法提取的供试品溶液中皂苷含量相对较高，故采用回流法作为供试品溶液的制备方法。同时对不同提取溶剂进行考察，包括甲醇、乙醇、75%乙醇、75%甲醇、水等，结果显示75%乙醇和75%甲醇提取效果较好，提取皂苷类成分较多且分离度较好，测定时不会对待测成分造成干扰。考虑到75%乙醇溶液安全性高，毒性小，且成本低廉，最终确定75%乙醇溶液为供试品的最佳提取溶剂。

本实验同时对5～18年生野山参药材中的9种皂苷类成分进行了测定，经方法学验证，该方法准确度高，重复性好，稳定可靠，可以用于野山参的质量控制，为野山参的有效成分基础研究工作奠定了基础，为野山参的药理研究、质量评价和质量控制提供了参考依据。