利用聚多巴胺制备丹参注射液缓释制剂的研究

朱辰奇　顾依　周琴　刘馨 沈惠明 陈志鹏

摘要 目的：利用聚多巴胺（PDA）对丹参注射液中多成分进行负载，构建丹参注射液（SMI）缓释制剂（PDA-SMI）。方法：建立丹参注射液的原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B3种成分的分析方法并进行含量测定;制备PDA，在pH值2.5的条件下对SMI进行负载，制备PDA-SMI;对PDA-SMI体外释放行为进行考察。结果：SMI中原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B的浓度分别为0.344、0.214、0.262 mg/mL;PDA-SMI对原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B的载药量分别为8.59%，15.90%和20.57%;PDA-SMI中原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B体外累计释放率分别为84.05%，77.57%和63.12%。结论：PDA可以负载SMI的多种成分，载药量较高，并具有良好的缓释效应。

关键词 丹参注射液;聚多巴胺;缓释制剂;高效液相色谱法

Study on Preparation of Danshen Injection Sustained-release Preparation Using Polydopamine

ZHU Chenqi1，2，GU Yi2，ZHOU Qin1，LIU Xin1，SHEN Huiming1，CHEN Zhipeng2

（1 Department of Pharmacy，Suzhou Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Suzhou 215002，China; 2 School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

Abstract Objective：To use polydopamine（PDA）to carry out multiple components of Salvia miltiorrhiza injection，and to construct a slow-release preparation of Salvia miltiorrhiza injection（SMI）（PDA-SMI）.Methods：Establish the analysis method of the three components of protocatechuic aldehyde，rosmarinic acid and salvianolic acid B of Salvia miltiorrhiza injection and determine the content; prepare PDA，load SMI under the condition of pH 2.5 to prepare PDA-SMI; The in vitro release behavior of PDA-SMI was investigated.Results：The concentrations of protocatechuic aldehyde，rosmarinic acid and salvianolic acid B in SMI were 0.344，0.214 and 0.262 mg/mL，respectively; the loading of protocatechuic aldehyde，rosmarinic acid and salvianolic acid B by PDA-SMI The doses were 8.59%，15.90% and 20.57% respectively; the cumulative release rates of protocatechuic aldehyde，rosmarinic acid and salvianolic acid B in PDA-SMI were 84.05%，77.57% and 63.12%，respectively.Conclusion：PDA can load multiple components of SMI and has a good sustained-release effect.

Keywords Salvia miltiorrhiza injection; Polydopamine; Sustained-release preparation; High performance liquid chromatography

中圖分类号：R283文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.15.009

随着人口老龄化程度日益加深，人们生活方式和饮食结构的改变，心血管疾病成为了威胁人类健康的头号杀手[1]。Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma是唇形科丹参属植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎[2]。研究表明，丹参中的多种成分对心血管可以发挥抗氧化、抗血小板聚集及心肌保护的作用[3-5]。丹参注射液（Salvia Miltiorrhiza Injection，SMI）是丹参水提醇沉后精制而成，是心肌梗死的住院患者使用频率最高的中药制剂，使用频率高达35.5%[6]。但是，SMI存在药物成分在体内代谢较快的问题，导致到达靶部位药量较少[7-8]。有必要设计中药新型制剂对SMI进行改善，能够负载SMI多成分的同时，具有一定缓释效应。

多巴胺可以在碱性环境下聚合形成聚多巴胺（Polydopamine，PDA）纳米粒[9]。PDA具有良好的生物相容性，可以对多种药物同时进行吸附[10-11]。本研究提出利用PDA对SMI中的多成分进行负载，构建中药新制剂PDA-SMI，赋予其缓释性能，有助于延长药物在体内滞留时间。见图1。

1 仪器与试药

1.1 仪器 电子天平（德国Sartorius公司，型号：BS-124S;高效液相色谱仪（岛津实验器材有限公司，型号：LC-2010A HT）;离心机（美国Thermo公司，型号：MicroCL）;纯水仪（美国Millipore公司，型号：Synergy UV）;超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-250DE）;激光粒度分析仪（英国马尔文仪器有限公司，型号：Malvern）;磁力加热搅拌器，金坛区西城新瑞仪器厂，型号：HJ-6;冷冻干燥机（美国LABCONCO公司，型号：Labconco 4.5 L）。

1.2 试剂 盐酸多巴胺，美国Sigma-Aldrich公司;对照品丹酚酸B（批号：111562-201912，质量分数>98%）、迷迭香酸（批号：11871-201908，质量分数>98%）、原儿茶醛（批号：114656-201907，质量分数>98%），中国食品药品鉴定研究院;甲醇（批号：MS1922-801）、乙腈（批号：19055249）均为色谱纯，購于美国天地有限公司;磷酸（批号：K1819049）为分析纯，氨水（浓度25%～28%，批号：L1719006），购于阿拉丁生化科技股份有限公司;纯水，南京中医药大学自制。

1.3 分析样品 丹参注射液（正大青春宝药业有限公司，批号：1908303）。

2 方法与结果

2.1 SMI中3种成分含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 采用Kcromasil 100-S-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～15 min，10%～20%乙腈;15～35 min，20%～25%乙腈;35～45 min，25%～30%乙腈;45～55 min，30%～90%乙腈;检测波长为288 nm;进样量为10 μL;体积流量为1.0 mL/min;柱温为30 ℃。

2.1.2 供试品溶液的制备 取SMI 1 mL，加入甲醇9 mL稀释，13 000 r/min，离心半径6 cm，离心10 min，取上清过0.45 μm滤膜，即得。

2.1.3 对照品溶液的制备 取原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B对照品适量，精密称定，分别置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇制成质量浓度分别为276、284、626 μg/mL的对照品溶液，置于冰箱4 ℃避光保存。

2.1.4 专属性考察 取“2.1.2”项供试品溶液，取“2.1.3”项对照品溶液，进样，结果见图2。在建立的色谱条件下，相邻峰之间分离度均大于1.5，方法专属性良好。

2.1.5 线性关系考察 取“2.1.3”项对照品溶液，用甲醇稀释成系列质量浓度的对照品溶液，过0.45 μm滤膜，进样，以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程分别为原儿茶醛Y=39 927 259.03X-23 297.25，r=1.000 0，线性范围0.276～138.000 μg/mL;迷迭香酸Y=19 065 233.51X+37 000，r=0.999 9，线性范围0.284～142.000 μg/mL;丹酚酸B Y=10 796 145.52X-21 041.079 59，r=1.000 0，线性范围0.626～313.000 μg/mL;结果表明在定量范围内各成分呈良好的线性关系。

2.1.6 中间精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下同一供试品溶液，连续进样6次，以各成分的峰面积值分别计算，计算原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 3种成分峰面积的RSD分别为0.15%、0.17%、0.20%，表明选用的仪器精密度良好。

2.1.7 重复性试验 按照“2.1.2”项方法配制供试品溶液，平行6份，进样，计算原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 3种成分质量浓度的RSD分别为1.75%、1.32%、1.46%，表明配制方法重复性良好。

2.1.8 供试品稳定性试验 取同一份“2.1.2”项下供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进行测定，计算原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 3种成分峰面积的RSD分别为0.78%、0.40%、0.97%，表明供试品溶液中各成分稳定性较好。

2.1.9 加样回收率试验 取已知3种指标成分含量的SMI，精密加入原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B混合对照品适量，配成质量浓度为待测成分含量的100%的溶液，每个质量浓度平行6份，计算各成分的加样回收率和RSD。计算原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 3种成分的平均加样回收率分别为99.82%、98.84%、102.39%，RSD分别为2.24%、2.15%、1.54%，表明本方法回收率良好。

2.1.10 样品测定 用外标法计算出SMI中的原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B的浓度分别为0.344、0.214、0.262 mg/mL。

2.2 PDA-SMI的合成和表征

2.2.1 PDA的合成 精密称取200 mg盐酸多巴胺溶于40 mL纯水中，搅拌至完全溶解，加入16 mL无水乙醇和1 mL氨水，磁力搅拌24 h，13 000 r/min，离心半径 6 cm，高速离心15 min，弃上清，沉淀用纯水洗3次，得到PDA纳米粒溶液，冻干后进行定量。

2.2.2 PDA-SMI制备及载药量测定 取2 mL SMI加入7 mL纯水中，混匀，用稀盐酸（1 M）调节pH至2.5，加入1 mL的含有2 mg PDA的纯水（pH值2.5），避光，磁力搅拌8 h，13 000 r/min，离心半径6 cm，高速离心15 min，取上清。通过“2.1.1”项下色谱条件进行测定，测定载药前后溶液中药量，如图2，并按公式分别计算各成分的载药量，载药量=（药物的原始质量-上清中残留药物的质量）/[PDA的质量+（药物的原始质量-上清中残留药物的质量）]，液相结果见图3。通过公式计算，原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B的载药量分别为6.59%，17.60%和20.75%，载药量较高。

2.2.3 粒径分布 用粒径测定仪PDA-SMI纳米粒粒径变化。见图4。载药后平均粒径为（305.1±6.8）nm，粒径分布较窄。

2.2.4 形态观察 取适量PDA-SMI溶于纯水中，滴至铜网，烘干，通过透射电镜TEM观察形态。PDA-SMI为球形纳米结构。见图5。

2.3 PDA-SMI体外释放实验 取PDA-SMI溶液放置于相对分子质量为800～1 000的透析袋中，释放环境为pH值7.4的PBS缓冲液，温度为37 ℃，按预定时间取释放溶液，补加同温同体积的PBS缓冲液，每个样品平行3份，计算累积释放量并绘制时间累积释放率曲线，结果见图6。在48 h内，原儿茶醛释放84.05%，迷迭香酸释放77.57%，丹酚酸B释放63.12%，具有明显的缓释效应。

3 讨论

3.1 载药指标成分的选择 原儿茶醛，迷迭香酸和丹酚酸B这3个成分是SMI中含量较高的成分之一，也是SMI治疗心血管疾病的主要药效成分。Wan等[12]研究发现，原儿茶醛可以通过抑制异丙肾上腺素（ISO）诱导的心肌组织纤维化和胶原沉积。Javidanpour等[13]研究表明，迷迭香酸可以抑制脂质过氧化和NCX1的过表达，提前给药可以预防心肌梗死后心肌肥厚、心律失常和心功能障碍的发生率。Zhang等[14]研究发现，迷迭香酸可以通过抑制AMPKα/Smad3信号通路，抑制心脏纤维化的产生。丹酚酸B促血管新生和抗ROS被广泛报道，有助于改善梗死部位的局部缺血和心肌细胞微环境[15-17]。PDA对丹参素载药量较低，故未将丹参素列为指标成分进行定量分析。

3.2 载药工艺的选择 前期研究中，验证了SMI在酸性环境的稳定性，确保了载药过程中药物自身的稳定性，并且利用PDA对丹参水提液中的成分进行了负载预实验，发现酸性环境下对多种水溶性成分存在明显的吸附效应。本研究选用SMI，分别对不同pH值（2.0，2.5，3.0，3.5和4.0）和不同载药时间（2、4、8 h）进行考察，比较不同pH值下的载药量，发现在pH值2.5时载药量最高，载药时间为8 h。载药前后电位数据表明载药机制为静电吸附，利用PDA在pH值小于4的环境下的正电荷，对SMI多成分进行吸附。PDA静电吸附的载药机制有助于保持药物分子的完整性，在中性环境下，pH值发生电荷翻转，引起吸附药物的缓释[18-19]。

3.3 小结 中药是多组分、多靶点及其组分间协同作用的复杂体系，大剂量负载中药多成分是开发中药新制剂的关键难点。本研究利用PDA对SMI中的主要药效成分成分进行一个高效率的负载，载药量较高，载药机制明确，可控性强，且具有明显的缓释效应，可以作为开发中药多成分复杂体系制剂的新策略。

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（2020-07-01收稿 責任编辑：王明）

基金项目：国家重点研发计划项目（2018YFC1706905）——中医药现代化研究;苏州市科技发展计划基金项目（SYSD2019187，SYSD2018242）作者简介：朱辰奇（1991.02—），男，硕士，药师，研究方向：中药新型制剂研究，Tel：（0512）62362103，E-mail：zhu65134@163.com通信作者：陈志鹏（1978.10—），男，博士，教授，研究方向：中药新型制剂研究，Tel：（025）85811071，E-mail：czpcpu@hotmail.com