神经炎症显像剂18F-PBR06的自动化制备

乔洪文 李 则 陈树安 梁志刚,2 卢 洁,3

1（首都医科大学宣武医院核医学科 北京 100053）

2（首都医科大学宣武医院信息中心 北京 100053）

3（首都医科大学宣武医院放射科 北京 100053）

神经炎症（neuroinflammation）是中枢神经系统应对损伤的炎症样胶质细胞应答，在自身免疫病、神经退行性疾病、脑卒中等多种疾病中均有发生。神经炎症一方面有利于脑组织和退行神经的修复而具有保护作用，另一方面也可能导致附带脑组织损伤、神经元缺失和失能而具有神经毒性［1-2］。正电子发射断层成像（PositronEmissioncomputed Tomography，PET）能够在体检测脑中神经炎症情况，最常用的显像剂为18 kDa转位蛋白（18 kDa Translocator Protein，TSPO）靶向分子探针。TSPO主要位于线粒体内外膜的接触点上，病理研究证明TSPO表达数量同小胶质细胞的状态相关。在健康脑组织中，处于休眠状态的小胶质细胞中TSPO表达较少；当小胶质细胞被激活时，TSPO的表达显著升高。小胶质细胞激活是神经炎症的主要表现之一，因此TSPO可以作为神经炎症PET显像的生物标志物［3］。

11C-PK11195是使用较多的第一代TSPO PET显像示踪剂，但是其存在以下缺点：第一、进脑量相对较低，非特异性摄取和血浆蛋白结合较高，导致PET图像信噪比和特异性较低，难以发现脑中神经炎症的微小改变；第二、标记放射性核素11C半衰期短（20 min），只能在有加速器的单位使用［4］。在过去的十几年中，第二代TSPO显像剂被开发并用于动物模型和人体的神经炎症显像研究。第二代显像剂根据结构的不同可以分为两类：第一类是N-苯甲基-N-（2-苯氧基芳基）-乙酰胺衍生物，包括11CDAA1106、11C-PBR28、18F-PBR06、18F-FEPPA等化合物；第二类是2-苯基吡唑-［1，5］嘧啶乙酰胺衍生物，包括11C-DPA-713、18F-DPA-714、18F-PBR111等化合物。评价研究表明第二代TSPO靶向分子探针的亲和性更高：相对于PK11195，11C-PBR28的靶向亲和性高5～6倍、18F-PBR06高11倍、11C-DPA-713高2倍、18F-DPA-714高1.5倍，高亲和性有利于改善PET图像信噪比［4-8］。第二代显像剂的药物动力学性质也有所提升，11C-PBR28人脑显像研究表明，小脑可作为该显像剂定量计算的参比区域。另一对比研究表明，11C-PBR28和18F-PBR06具有类似的体内动力学性质［9］。

为了推动神经炎症PET显像临床研究，本研究开展了二代TSPO分子探针18F-PBR06自动化制备工艺研究：开发Neptis Perform型合成仪适用的一次性管路系统及配套流程，实现稳定、高效生产18FPBR06制剂；参考中国药典2015年版，制定了18FPBR06注射液的质量标准及检验方法；通过异常毒性检查考察了制剂的安全性；通过正常小鼠实验考察了制剂的体内生物分布情况。在以上工作的基础上，本研究开展了PET/CT显像预试验。以上研究为18F-PBR06在科研和临床中的进一步应用奠定了基础。

1 材料

1.1 试剂

前体和标准品按照文献合成［10］，色谱纯度大于99%。氨基聚醚222 mL、250 mL软包注射用水、一次性管路组装耗和注射器材购于德国ABX公司。固相萃取柱购于美国Waters公司。无菌滤膜购于美国默克密理博（Merck Millipore）公司。细菌内毒素检测卡（灵敏度5～0.05 EU∙mL-1）购于湛江安度斯生物有限公司，其余试剂均购于美国Simga-Aldrich试剂公司。

1.2 仪器

加速器为德国西门子公司RDS-111型。放射性药物合成仪为比利时ORA公司Neptis Perform型，配备美国安捷伦公司C18色谱柱（250 mm×9.6 mm，5 μm）。分析型高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）为安捷伦公司1260型，配备美国菲罗门C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Bioscan公司在线放射性检测器。气相色谱为安捷伦公司7890型，配备Restek气相色谱柱（0.53 mm内径，1 μm聚乙烯醇涂层）和氢火焰检测器。pH为美国Fisher公司Onion型，配备微型探头。内毒素检测仪为美国查尔斯河实验室公司PTSEndotoxin型。活度计为美国CAPINTEC INC公司CRC-25R型。

1.3 实验动物

昆明小鼠购于北京市海淀区兴隆实验动物养殖场，共20只，雄性，体重19.0～22.3 g。动物实验已通过首都医科大学伦理委员会批准。

2 方法

2.1 18F-PBR06自动化合成

用于18F-PBR06制备的一次性管路结构如图1所示，制备所需溶液通过注射器加载到一次性管路上：在淋洗液位置加载0.6 mL氨基聚醚222（K222）/K2CO3溶液（10 mg K222和 2 mg K2CO3溶解于0.3 mL乙腈和0.3 mL水）；第一个五联阀3位置加载2.5 mL无水乙腈；第一个五联阀5位置加载含有2 mg标记前体化合物的1.5 mL无水DMSO溶液；第二个五联阀3位置加载6 mL注射用水；第二个五联阀5位置加载10 mL注射用水。在制剂化五联阀的2位置加载250 mL注射用水；4位置加载含有1.5 mL无水乙醇；在5位置加载3.5 mL含有0.5%抗坏血酸钠的生理盐水溶液；Oasis固相萃取柱后三通阀常闭端通过注射针头加载含有10 mL 0.5%抗坏血酸钠-生理盐水溶液的制剂化瓶。制剂化瓶上加载长穿刺针头，然后通过一次性管路连接0.22 μm无菌滤膜，通入到最终产品瓶中。在半制备HPLC系统处加载流动相（乙腈/20 nmol∙L-1pH 6.7磷酸盐缓冲溶液=70/30），设置流速3 mL∙min-1，UV检测器设置检测波长230 nm。

图1 适用于Neptis Perform型合成仪器的18F-PBR06制备一次性管路结构和加载的试剂Fig.1 Schematic of the disposable cassette for18F-PBR06 preparation with Neptis Perform synthesizers and reagents

18F-PBR06制备程序通过预设时间控制仪器运行：含18F离子的加速器靶水在负压作用下通过离子交换QMA柱（说明：QMA柱为生产商Waters公司的商品名）柱，然后用K222/K2CO3溶液将放射性活度从QMA柱上淋洗并加入到反应瓶中，加热至95℃并蒸发干燥；抽取约0.6 mL无水乙腈并加入到反应瓶中，再次蒸发干燥；反应瓶减压，将前体溶液加入到反应瓶中，加热至140℃反应15 min，放射化学反应式如图2所示；反应溶液冷却至60℃，然后加入第二个五联阀5位置上的10 mL水进行稀释；所得溶液通过30 mg Oasis HLB固相萃取小柱；用第一个五联阀3位置上剩余的乙腈将粗产品洗脱，并加入到第三个五联阀4位置的30 mL注射器中，用6 mL水冲洗Oasis小柱，并稀释粗产品溶液；将粗产品溶液进样到HPLC系统中进行纯化，监测放射性和紫外吸收色谱图，根据放射性信号收集含有目标产物的流动相（目标产物峰保留时间约为14 min）。收集的流动相加入到制剂化五联阀3位置的储液罐中；从2位置抽取30 mL注射用水稀释上述流动相，所得溶液通过1 mL Oasis HLB固相萃取柱；再次从2位置抽取30 mL注射用水，冲洗1 mL Oasis HLB柱；用1.5 mL乙醇将目标化合物从1 mL Oasis HLB柱上洗脱并加入到产品制剂化瓶中；用5位置上的3.5 mL生理盐水溶液冲洗1 mL Oasis柱，并加入到制剂化瓶中；在仪器氮气压力推动下，制剂化瓶中溶液通过无菌滤膜进入最终产品瓶，制得18F-PBR06注射液。

图2 制备18F-PBR06的化学反应式Fig.2 Chemical reaction formula of18F-PBR06 preparation

2.2 18F-PBR06注射液质量控制分析

18F-PBR06注射液的质量控制标准参考中国药典2015年版相关规定及已收录品种制定［11］，检验内容表1。合成结束后，首先用注射用水冲洗生产中使用的0.22 μm无菌滤膜，然后通过起泡点检测考察滤膜完整性，然后从产品瓶中抽取2 mL制剂溶液用于质量控制分析：将1 mL质控样品加入到无菌瓶中，待衰变后进行无菌检测。将剩余1 mL样品加入到无菌试管中，用于其他项目质控分析：首先在明亮的灯光下于铅玻璃后目视进行外观检查；移取20 μL样品用细菌内毒素检测用水稀释50倍，用于进行内毒检测；移取500 μL样品，通过活度计测定放射性浓度和半衰期；移取100 μL样品，用色谱级水稀释50倍，进行气相色谱分析检测残留溶剂（色谱条件为：柱温200℃，进样口温度跟随柱温，检测器温度240 ℃，氢气流速 30 mL∙min-1，进样量 1 μL）；取100 μL样品，通过pH计测定pH值；取20 μL样品进行HPLC分析（流动相为：含氟化钾1 g∙L-1的乙腈/pH 6.7磷酸盐缓冲溶液=70/30，流速1 mL∙min-1，检测波长230 nm），进行放射化学鉴别、放射化学纯度、化学杂质和18F-PBR06含量测定；取2 μL样品，通过比色法进行K222限量检查。

2.3 18F-PBR06注射液异常毒性检查

取雄性昆明小鼠5只（体重19.0～20.6 g），通过尾静脉注射在5 s内匀速注射0.5 mL采用上述工艺制备的18F-PBR06注射液，注射液的放射性活度为22.94～19.62 MBq。注射完成后将小鼠置于安静环境，保证充足食物和饮水供应，并按照12 h节律提供照明。每隔12 h观察小鼠生存状态，共观察48 h。

2.4 18F-PBR06在正常小鼠体内分布研究

取雄性昆明小鼠15只（体重19.7～22.3 g），随机分为3组，每组5只。通过尾静脉向小鼠体内注射放射性活度为0.74 MBq的18F-PBR06注射液。注射后将小鼠置于安静环境并保证食水供应，然后在不同时间点（5 min、30 min、60 min）断颈处死，解剖提取血液、心脏、肺、脾、肝、肾、肌肉、股骨、脑，用天平称重，并用γ计数器测量放射性计数。通过与注射剂量的1%对照样品比较，计算单位质量组织中的放射性摄取量（%ID/g）。

2.5 18F-PBR06 PET/CT显像预试验

本研究经首都医科大学宣武医院伦理委员会审查，获得批准后实施，纳入临床诊断为正常的志愿者一名（女性，39岁），多发性硬化患者一名（女性，35岁），受试者签署知情同意书后进行试验。入组的多发性硬化患者病史7年余，依据2017年版McDonald诊断标准确诊为继发进展型多发性硬化。受试者经肘静脉弹丸式注射18F-PBR06制剂370 MBq，然后于低刺激环境中休息；60 min后以动态模式采集头部PET数据30 min。PET数据采用OSEM方法重建（子集4，迭代24，矩阵256×256）。在PET图像上勾画皮层、白质、丘脑、中脑、小脑等感兴趣区，并以小脑为参考区计算标准摄取比（Standardized Uptake Value ratio，SUVr）。

3 结果与讨论

3.1 18F-PBR06自动化合成

神经炎症PET显像在过去的10年中发展迅速，并在多发性硬化和阿尔兹海默病等疾病研究中已有较多应用，在帕金森病和脑卒中的研究中也取得了一些成果［12］。性质优良的显像剂是开展PET研究的必要条件。本研究选择具有较好生物性质的神经炎症显像剂18F-PBR06，利用Neptis Perform型合成仪开展了该显像剂的制备研究。使用本研究开发的一次性管路系统和流程，18F-PBR06注射液制备总耗时为50～58 min（n=20），其中18F离子纯化和干燥耗时约9 min，氟化反应耗时约16 min，HPLC纯化耗时约15 min，制剂化过程约10 min，18F-PBR06放射化学产率为（32±5）%（经衰减校正，n=20）。2009年Briard等［13］首次报道了18F-PBR06的制备，使用以溴基为离去基团的前体化合物和TRACERlab FXF-N型合成装置，制备18F-PBR06的放射化学产率为12.2%（n=6）。在同年的报导中该方法被用于18F-PBR06人体显像研究。在2014和2015年报道的评价研究中，使用以溴基为离去基团的前体化合物制备18FPBR06的产率较低，仅为（2.1±0.7）%（n=10）和（2.17±0.38）%（经衰减校正）［14-15］。2011年Wang等设计合成了以对甲苯磺酰基为离去基团的前体化合物，使该组研制的合成仪器，18F-PBR06制备产率提高至30%～60%（经衰减校正），而且改善了产品制剂的化学纯度。本研究使用一次性管路系统制备18FPBR06的产率同已报道结果具有可比性［9，16］。

本研究优化18F-PBR06半制备色谱纯化条件：采用乙腈/20 nmol∙L-1pH 6.7磷酸盐缓冲溶液=70/30流动相，目标化合物保留时间约为14 min，与非放射性杂质有较好分离度。当采用乙腈/磷酸盐缓冲溶液=75/25流动相时，目标化合物保留时间为11 min，由于杂质UV色谱峰拖尾，导致目标化合物放射性色谱峰同杂质峰有部分重叠。降低流动相中乙腈含量可使目标化合物保留时间进一步延长，且获得较好分离度，但是会导致总合成时间延长，因此本研究采用乙腈/20 nmol∙L-1pH6.7磷酸盐缓冲溶液=70/30作为产品纯化流动相。本研究采用的反应时间为15 min，未作进一步优化，计划在后续工作中予以改进，从而减少制备时间。

3.2 18F-PBR06注射液质量控制分析

18F-PBR06注射液的生产工艺通过连续生产的三个批次进行验证，制剂质量控制分析结果均合格，具体结果如表1所示。稳定性研究表明：将三个验证批次产品溶液置于室温下6 h，然后进行第二次质量检测，产品的放射化学纯度、化学杂质和19FPBR06含量均未发生明显变化，这表明18F-PBR06注射液在室温下6 h内具有良好的稳定性。工艺验证完成后，本研究进行了17次18F-PBR06注射液的生产，质量控制分析结果均为合格，因此使用一次性管路系统及其流程生产的18F-PBR06制剂能够满足临床显像研究和应用的要求。

3.3 18F-PBR06注射液异常毒性检查

根据中国药典2015年版通则1141“异常毒性检测法”，对采用本工艺生产的18F-PBR06注射液进行了异常毒性检查，结果表明：给药48 h后5只小鼠均存活，且状态未见异常；解剖分析可见，受试小鼠脏器未发生明显改变。以上结果证明本研究工艺在制备18F-PBR06注射液过程中未引入外源性毒性物质及不安全因素。

图3 18F-PBR06产品制剂质量控制分析HPLC色谱图(a)产品制剂放射性色谱图，18F-PBR06保留时间为10.394 min，(b)产品制剂UV色谱图，(c)对照化合物PBR06的分析HPLC色谱图，PBR06保留时间为10.221 minFig.3 18F-PBR06 product HPLC chromatograms for quality control analysis(a)Radioactive chromatogram of product,retention time of 18F-PBR06 is 10.394 min,(b)UV chromatogram of product,(c)UV chromatogram of reference compound,the retention time of PBR06 is 10.221 min

3.4 18F-PBR06在正常小鼠体内的生物分布研究

18F-PBR06在小鼠各器官中的分布见表2。肺中初始摄取最高，然后以较快速度洗脱，这可能是由于肺中TSPO表达较高，在初始阶段合并血液中的放射性活度，因此表观摄取最高，随后放射性摄取随血液洗脱。肾、心脏、脾等器官放射性摄取较高，这与以上器官中TSPO高表达的生物学特性一致。18FPBR06在血液中清除速度快，在肌肉和骨中有一定摄取。脑中摄取的放射性较低，而且以较快速度洗脱，这可能与正常小鼠脑中胶质细胞处于休眠状态和TSPO表达较少有关。18F-PBR06在正常小鼠体内的分布与文献报道的在猴和正常人体内的分布趋势一致［8］。

3.5 18F-PBR06 PET/CT显像预试验

健康受试者头部PET/CT显像图像如图4（a）所示，皮质区域可见轻度放射性摄取，额叶、顶叶、颞叶、枕叶相对小脑的SUVr分别为1.06、0.95、1.02、1.01；楔叶区域摄取略高，SUVr为1.06；丘脑和脑桥区域摄取最高，SUVr分别为1.16和1.17；脑白质区域放射性摄取最低，SUVr为0.65，以上放射性摄取同TSPO在正常人脑中的自然分布情况相符［3，8］。此外，受试者颅骨区域有高放射性浓集，说明18FPBR06在人体内可能发生了脱氟代谢。多发性硬化患者头部PET/CT显像图像如图4（b）所示，可见患者丘脑、桥脑和白质区域放射性摄取升高（见B图中箭头标注），丘脑区域的放射性摄取较正常人明显增加，SUVr为1.50，且两侧摄取不对称，这与右侧躯体症状较重对应；脑桥和白质摄取也有明显升高，SUVr分别为1.39和0.79；额叶、顶叶、颞叶、枕叶以及楔叶皮质中的放射性摄取略有上升，SUVr分别为1.12、1.01、1.10、0.99和1.16。

表1 18F-PBR06注射液的质量控制标准及检验方法Table 1 [18F]PBR06 injection quality control standards and methods

表2 18F-PBR06在正常小鼠体内的生物分布（n=5，%ID/g）Table 2 The biodistribution of18F-PBR06 in normal mice(n=5,%ID/g)

健康受试者脑中放射性活度分布与文献报道的在国外进行的PET显像一致［17-18］。多发性硬化患者脑中放射性摄取升高区域，同核磁共振成像检查提示的丘脑、桥脑、侧脑室旁区域存在病灶的发现一致。需要注意的是18F-PBR06在脑中摄取绝对值比较低，而且不同患者病灶区分布不同，因此PET图像视觉分析和手动勾画感兴趣区的难度较大，需要进一步建立基于全脑的图像自动化分析方法，提高图像评判的准确性。

图4 18F-PBR06在健康对照(a)和多发性硬化患者(b)脑中的PET/CT显像结果Fig.4 The PET/CT imaging of18F-PBR06 in health control(a)and multiple sclerosis patient(b)

4 结语

本研究开发了适用于Neptis Perform型合成仪的一次性管路系统及相应控制流程，实现了TSPO显像剂18F-PBR06自动化制备；根据中国药典2015年版中的相关规定及收录的正电子核素标记放射性药物，制定了18F-PBR06产品制剂的质量标准及检验方法。20次制备产品制剂的检验结果表明，采用一次性管路系统制备的18F-PBR06满足质量标准要求。异常毒性检查结果表明，在使用本工艺制备18FPBR06注射液的过程中未引入不安全因素。综合动物分布研究和PET/CT显像预试验结果可知，采用本研究制备的18F-PBR06注射液可用于中枢神经系统神经炎症PET显像研究。