CTLA4基因多态性与不明原因习惯性流产发生风险关系

毕晓英 王丹丹 许 珂

河南中医药大学第三附属医院(郑州，450008)

反复自然流产 (UHA)在妊娠者中发生率为1%～5%[1]，该病发生机制复杂，研究认为染色体异常、子宫疾病、感染、内分泌异常等因素可能与反复流产有关，但仍有一半以上患者病因不明确[2]。细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)属T细胞功能负调控因子，在调控多类自身免疫病的发生中发挥重要作用[3]。近期研究显示CTLA-4基因多态性会影响母体与胎儿间的免疫耐受性，进而导致流产[4]。然而其基因多态性在UHA中的作用报道不多，本研究探究CTLA-4基因多态性与UHA发生关系，为UHA发生机制研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2017年9月—2018年5月在本院治疗的UHA患者98例(观察组)，年龄(27.9±4.7)岁(20～41岁)。纳入标准：①无成功受孕史，流产≥2次且妊娠周数≤20周；②影像学检查生殖器官发育正常；③患者知情同意。排除标准：①夫妻双方染色体异常；②多囊卵巢综合征及黄体功能不全；③糖尿病、甲状腺功能异常者；④免疫系统异常，如系统性红斑狼疮、抗精子抗体；⑤男方原因不孕。另选同期本院孕检正常妊娠者107例作为对照组，均有1次以上成功受孕史，未出现自然流产，年龄(27.9±4.7)岁(21～40岁)，与观察组年龄比较无差异(P>0.05)。

1.2 实验室检测

1.2.1试剂仪器及取样全血DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)；CTLA4基因rs5742909、rs4553808、rs231775位点扩增引物(生工生物工程有限公司)；PCR检测试剂盒(宝生物工程公司)；白介素-2(IL-2)、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-4、IL-6、IL-10检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；凝胶成像仪(英国Syngene公司)。取两组对象晨空腹静脉血离心收集上清，于-20℃保存。

1.2.2检测CTLA4基因位点分型DNA提取试剂盒提取血液中DNA，分光光度计检测提取DNA纯度，当260/280波长1.7～2.0时表明DNA纯度较好，用于后续检测。聚合酶链式反应-限制性片段多态性(PCR-RFLP)反应体系为25μl，PCR mix12.5μl，上下游引物(rs5742909、rs4553808、rs231775位点)各0.35μl，Taq enzyme 0.25μl，DNA template 1μl，添加ddH2O至总体积为25μl。反应条件：94℃预变性3min；94℃预变性3min，56℃退火 30s，40个循环。反应结束后，进行限制性酶切反应，rs5742909、rs4553808、rs231775内切酶分别为MseI、MseI、BbvI，酶切体系共15.5μl，缓冲液1.75μl，内切酶0.75μl，PCR反应产物5μl，补充ddH2O至25μl，37℃过夜反应后，取5μl酶切产物于3%凝胶电泳中电泳，凝胶成像仪内观察分型，保存结果。

1.2.3血清指标检测酶联免疫吸附法检测血清IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10水平，操作参照试剂盒说明书。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 两组血清Th1型、Th2型细胞因子水平

与对照组相比，UHA组血清IFN-γ、TNF-α、IL-2水平均升高，IL-4、IL-6、IL-10水平均降低(P<0.05)。见表1。

表1 两组血清各检测因子水平比较

2.2 CTLA4基因多态性

rs5742909位点存在多态性，酶切后出现3种基因分型，包括野生型纯合基因CC(226bp、21bp)，突变杂合基因型CT(226bp、130bp，96bp、21bp)，突变纯合基因型TT(130bp、96bp、21bp)；rs4553808位点存在多态性，酶切后出现三种基因分型，包括野生型纯合基因AA(333bp、153bp)，突变杂合基因型AG(486bp、333bp、153bp)，突变纯合基因型GG(486bp)；rs231775位点存在多态性，酶切后出现三种基因分型，包括野生型纯合基因AA(329bp)，突变杂合基因型AG(329bp、245bp、84bp)，突变纯合基因型GG(245bp、84bp)。见图1～3。

图1 rs5742909 PCR-CTPP产物电泳图

图2 rs4553808 PCR-CTPP产物电泳图

图3 rs231775 PCR-CTPP产物电泳图

2.3 Hardy-Weinberg遗传平衡验证

两组CTLA4基因rs5742909、rs4553808、rs231775位点实际基因频率与理论值比较无差异(P>0.05)，各位点基因频率表现稳定，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。见表2。

表2 两组CTLA4基因各位点遗传平衡检验(实际值/理论值)

2.4 各组rs5742909、rs4553808、rs231775基因型频率对比

观察组rs5742909位点T等位基因频率及rs231775位点G等位基因频率均高于对照组(P<0.05)；rs4553808不同基因型频率两组比较无差异(P>0.05)。见表3。

表3 各组rs5742909、rs4553808、rs231775基因型频率对比

2.5 rs5742909 、rs231775基因型与UHA患者Th1、Th2细胞因子关系

rs5742909、rs231775不同基因型者血清IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10水平存在差异(P<0.05)。见表4。

表4 不同基因型者血清各检测因子水平比较

2.6 发生UHA风险的logistic回归分析

以rs5742909 CC、C等位基因型为参照，TT、TC及T等位基因携带者发生UHA相对危险度有差异；以rs231775 AA型、C等位基因为参照，AG、GG及T等位基因携带者发生UHA相对危险度有差异(P均<0.05)。rs4553808基因型及等位基因频率与UHA发生风险不相关(P>0.05)。见表5。

表5 基因多态性与UHA发生风险的logistic回归分析

3 讨论

UHA属于临床常见妊娠期并发症，80%～90%的产妇发生在妊娠早期，临床对其发生机制进行了大量研究，主要涉及子宫畸形、染色体异常等，但具体发生机制尚未阐明[5]。免疫学研究发现胚胎与母体间的免疫应答使胎儿产生免疫耐受，对胎儿生存有利。其中母体T淋巴细胞在免疫耐受中发生着重要作用，CTLA-4不仅可诱导Th1/Th2细胞分化，还对T淋巴细胞活化具有抑制作用[6]。过往研究显示CTLA-4 mRNA及蛋白水平异常后可抑制T淋巴细胞效应，降低母体与胎儿间的免疫耐受作用[7]。近期研究发现CTLA-4基因多态性可能影响CTLA-4对T细胞的抑制功能，进而引发流产[8]。因此研究UHA患者CTLA-4基因多态性对于探究UHA免疫发病机制具有重要意义。

目前CTLA-4基因多态性位点研究较多的有rs733618、rs5742909、rs4553808、rs231775等。rs231775位点A突变后可以产生产物Ala17Thr，目前此位点研究最多。研究发现rs231775启动子外显子149位点为A时，CTLA-4表达水平较高，当该位点突变为G时，CTLA-4表达水平降低，对T细胞抑制的活性也降低[9]。此外rs231775 位点G携带者T淋巴细胞中CTLA-4表达水平低于A携带者[10]。Mortaza等通过对流产患者、正常妊娠者CTLA-4基因rs231775 位点多态性检测发现两组GG、AG基因型频率比较差异显著，且流产患者G等位基因频率较高[11]。本研究发现与对照组相比，观察组rs231775位点G等位基因频率显著升高，且两组间不同基因型频率比较有差异，提示UHA患者CTLA-4基因rs231775 位点 A→G突变可能与UHA的发生相关；logietic回归分析发现rs231775位点G基因携带者发生风险较高，提示rs231775 位点 A→G突变是UHA的危险因素。rs4553808位点等位基因由A突变为G后，该位点可与c/EBPβ转录因子结合，进而调控CTLA-4基因转录，影响细胞的增殖、凋亡。过往研究显示rs4553808位点基因多态性与慢性丙型肝炎感染、乳腺癌易感性有关[12-13]；然而本研究发现两组rs4553808位点各基因型AA、AG、GG基因频率比较无差异性，且等位基因G与A等位频率无差异性，logietic回归分析发现rs231775位点基因多态性与UHA的发生风险无关，分析原因可能为纳入患者疾病类型、年龄等差异所致。有研究发现当rs5742909位点为T等位基因时，细胞内CTLA-4表达水平升高，可进一步释放TGF-β，降低T细胞反应性，抑制Th1型细胞产生IL-2，进而使母体-胎儿免疫维持在动态平衡，因此当rs5742909位点发生突变后，会影响Th1/Th2免疫平衡，进一步影响妊娠结局[14]。许广力等[15]研究显示rs5742909位点多态性与妊娠早期发生流产无明显相关性。而本研究发现两组rs5742909位点不同基因分型、等位基因频率间具有差异性，进一步分析发现rs5742909位点C→T突变后可增强UHA的发生风险，提示rs5742909位点C→T突变为UHA发生的危险因素。

有研究证实Th1/Th2细胞免疫平衡与妊娠结局密切相关，正常妊娠情况下Th1型细胞因子呈低表达，Th2型细胞因子呈高表达，当Th1型细胞因子水平升高后诱发流产[16]。CTLA-4可通过影响T细胞效应活性进而影响T细胞耐受，维持Th1/Th2细胞免疫平衡，当CTLA-4基因发生突变后影响其功能，破坏Th1/Th2细胞免疫平衡，参与流产的发生[17]。目前对于CTLA-4位点基因型与Th1/Th2细胞因子的关系研究不多。本研究发现rs5742909、rs231775不同基因型者血清Th1/Th2细胞因子水平存在差异，推测rs5742909、rs231775位点发生突变后影响CTLA-4基因功能，进而导致Th1/Th2免疫失衡，引发胎儿有害的免疫反应，提示rs5742909、rs231775位点基因多态性可能与Th1/Th2免疫平衡有关。

综上所述，CTLA4基因rs5742909、rs231775位点多态性与UHA发生相关，rs5742909位点C→T突变、rs231775位点A→G突变可增加UHA的发病风险，这可能与Th1/Th2免疫失衡有关。然而本研究纳入病例不多，数据分析结果可能存在一定的偏差，还有待后续纳入多样本量验证结果，为探究UHA的病理机制提供充分的论据。