臭氧水漂洗对鲅鱼鱼糜品质及肌原纤维蛋白氧化的影响

李文协,李学鹏,*,刘慈坤,王金厢,朱文慧,徐永霞,仪淑敏,励建荣,李婷婷,牟伟丽,郭晓华

(1.渤海大学食品科学与工程学院,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,国家鱼糜及鱼糜制品加工技术研发分中心,辽宁锦州 121013;2.大连民族大学生命科学学院,辽宁大连 116600;3.蓬莱京鲁渔业有限公司,山东烟台 265600;4.山东美佳集团有限公司,山东日照 276815)

近几年,我国鱼糜制品年产量达到150多万吨,行业产值规模已超过200亿元,成为水产品加工业中发展最快的行业门类之一[1]。我国鲅鱼的年捕获量约40多万吨,是生鲜海水产品中的重要组成部分[1]。目前鲅鱼主要以鲜销和冻品为主,部分鲅鱼也会被制成咸干制品如熏鲅鱼片、鲅鱼罐头等产品。为了提升鲅鱼的经济价值,常将鲅鱼制作成冷冻鱼糜,但是由于鲅鱼肌肉中的红肉部分含量较高,导致生产的鱼糜色泽较暗,且存在腥味重等问题,严重影响其感官品质和销售范围。

臭氧不仅是一种可直接接触食品、公认安全、广谱高效的杀菌剂,还因本身具有强氧化性,常在水产品加工中作为漂白剂和脱腥剂使用。Zhang等[2]用臭氧水漂洗鳙鱼鱼糜,发现其土腥味物质显著降低。Zhang等[3]发现白鲢鱼糜用8 mg/L的臭氧水漂洗后白度值提高,而凝胶性能不受影响。目前臭氧水在淡水鱼糜加工方面的研究较多,而其对海水鱼鱼糜的影响仍鲜见报道。此外,由于臭氧在水中可发生氧化还原反应,生成具有较高反应活性的羟自由基、超氧阴离子自由基及氢化臭氧自由基等多种活性氧自由基,这些活性氧自由基可作用于蛋白质引发氧化效应,最终导致半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸等氨基酸侧链修饰、蛋白质构象变化、蛋白质交联或降解等变化[4]。随着臭氧在食品加工中的应用越来越广泛,臭氧引起的蛋白质氧化也逐渐被关注[5]。Segat等[6]研究了高浓度臭氧处理对乳清分离蛋白结构和功能性质的影响,发现臭氧处理导致乳清分离蛋白活性巯基含量减少,α-螺旋显著增多,起泡性显著提高,而溶解性和乳化性降低。Zhang等[7]研究发现适度臭氧处理可以提高鳙鱼肌原纤维蛋白羰基含量和凝胶强度。Jiang等[8]发现轻度臭氧处理后鲢鱼肌球蛋白羰基含量、表面疏水性增加,巯基含量减少,α-螺旋显著减少,蛋白质结构展开并发生一定的交联。但目前臭氧水漂洗引起的鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白氧化效应尚未见报道。鉴于此,本研究用不同浓度的臭氧水漂洗鲅鱼鱼糜,通过分析漂洗前后鲅鱼鱼糜的色泽、风味等感官品质以及肌原纤维蛋白结构性质的变化,探究臭氧处理对鲅鱼鱼糜品质及其肌原纤维蛋白氧化的影响规律,以期为臭氧水漂洗在鲅鱼鱼糜品质改良中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷冻鲅鱼(体重0.5～0.6 kg) 锦州市第一综合农贸市场;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠、氢氧化钠、硫酸铜、盐酸胍、乙酸乙酯、乙醇、尿素、三氯乙酸(TCA)、酒石酸钾钠、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(5,5′-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB)、2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazone,DNPH)、乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、8-苯胺基-1-萘磺酸铵(8-Anilino-1-naphthalenesulfonate,ANS)、2(β)-巯基乙醇、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸等 均为分析纯,锦州药业集团器化玻有限公司;SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 北京索莱宝科技有限公司。

Chroma Meter CR 400色差仪 日本Konica-Minolta公司;PEN3便携式电子鼻系统 德国Airsense公司;固相微萃取装置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头、20 mL顶空钳口样品瓶 美国Supelco公司;7890N/5975GC-MS联用仪 美国Agilent公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司;UV-2550紫外可见光分光光度计 岛津仪器(苏州)有限公司;970CRT荧光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;LabRAM HR Evolution共焦拉曼光谱仪 堀场(中国)贸易有限公司;Mini Protran 3凝胶电泳仪 美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 臭氧水的制备 参考刘慈坤[9]的方法,采用TK-DJ-S08型臭氧发生器制备臭氧水,用碘量法测定臭氧水的浓度,然后将臭氧水的浓度稀释为0、2、4、6、8和10 mg/L。

1.2.2 鲅鱼鱼糜的制备 把冷冻的鲅鱼流水解冻后去除头部、尾部和内脏淤血等,用刀沿鱼背部将鱼分成两半,然后用采肉机将鱼肉与鱼骨、鱼皮分离;进行第一次漂洗,按照鱼肉∶冷蒸馏水=1∶5 (w/v)混合搅拌漂洗15 min,接着将混合液倒入过滤网兜,放入脱水机中脱水2000 r/min,脱水5 min;再用臭氧水进行第二次漂洗,按照鱼肉∶臭氧水=1∶5 (w/v)混合搅拌漂洗15 min(先将称量的鱼肉放入容器中,然后将称量的臭氧水倒入容器中),然后将混合液倒入过滤网兜,放入脱水机中脱水2000 r/min,脱水5 min;最后用含有0.15% NaCl溶液对鱼肉进行第三次漂洗,按照鱼肉∶NaCl溶液=1∶5 (w/v)混合搅拌漂洗15 min,然后将混合液倒入过滤网兜,放入脱水机中脱水2000 r/min,脱水15 min,使鱼糜水分含量在78%左右。将得到的鱼糜过精滤机,然后过斩拌机加入4%(w/w)的白砂糖和4%(w/w)山梨糖醇,在0～4 ℃温度下斩拌1 min,真空包装放在-80 ℃冰箱备用。在整个实验过程中,鱼肉样品的温度保持在10 ℃以下。

1.2.3 鲅鱼鱼糜色泽的测定 将鲅鱼鱼糜放到直径10 cm的培养皿中铺展平整,利用色差计测定样品的色泽。首先用标准白板进行校准,在室温下每个样品随机测定4个不同位置的色泽作为平行。L*为亮度值;a*为红度值(正值表示偏红,负值表示偏绿);b*为黄度值(正值表示偏黄,负值表示偏蓝)。白度值(W)由公式(1)计算得到。

式(1)

1.2.4 电子鼻测定 准确称取鲅鱼鱼糜样品5.0 g,放入50 mL的离心管中,迅速用5层保鲜膜封口,然后置于4 ℃冰箱中静置30 min,用于电子鼻检测。检测条件:电子鼻清洗时间为100 s,测定时间120 s;顶空温度25 ℃;内部流量300 mL/min;进样流量300 mL/min。每个样品重复测定4次。主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)使用PEN3电子鼻的Win Muster软件处理稳定后第105～107 s的数据信息。

1.2.5 固相微萃取-气相色谱-质谱检测(SPME-GC-MS) 固相微萃取:将2.5 g鱼糜样品放入20 mL顶空瓶中,加入6 mL饱和氯化钠溶液、2 μL标准品无水乙醇环己酮(5 mL无水乙醇+5 μL环己酮),立即加盖;将顶空瓶放于45 ℃水浴磁力搅拌器中平衡15 min。用已经活化的DVB/CAR/PDMS 50/30 μm萃取针(270 ℃活化60 min)顶空吸附40 min,然后将萃取针插入GC进样口,解吸5 min。

气相色谱-质谱分析:参考崔方超等[10]的方法,气相色谱条件:HP-5MS毛细管柱(40 m×0.25 mm,0.25 μm);进样口温度250 ℃;不分流模式进样;载气为He;流速1.0 mL/min;程序升温:柱初温40 ℃,保持2 min,以4 ℃/min 升至160 ℃,保持1 min再以10 ℃/min升至250 ℃,保持5 min。质谱条件:GC-MS接口温度280 ℃;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;电离方式:EI;电子能量70 eV;质量扫描范围30～550(m/z)。挥发性物质的定性分析利用C5～C25正构烷烃的匹配质谱及对计算机谱库(NIST 11/Wiley 7.0)进行检索。

1.2.6 肌原纤维蛋白的提取 参考刘慈坤[9]的方法,提取肌原纤维蛋白。采用双缩脲法测定蛋白浓度。

1.2.7 羰基含量的测定 参考Oliver等[11]的方法进行测定。用10 mmol/L Tris-HCl缓冲液(含0.6 mol/L NaCl,pH7.2)将提取的肌原纤维蛋白配制成5 mg/mL蛋白溶液,取1 mL肌原纤维蛋白溶液放入50 mL塑料离心管并加入1 mL 10 mmol/L DNPH溶液(含2 mol/L HCl),室温条件下避光静置1 h(每15 min,振荡一次),添加3 mL 20%的TCA后10000 r/min离心5 min,弃上清液,用1 mL乙酸乙酯-乙醇(V/V=1∶1)清洗沉淀3次后,加入5 mL 6 mol/L盐酸胍溶液,37 ℃保温30 min使沉淀溶解,10000 r/min离心5 min去除不溶物,所得溶液于370 nm波长下测定吸光度。每个处理组测定3次。

1.2.8 总巯基含量的测定 参考Yongsawatdigul等[12]的方法测定总巯基含量。用10 mmol/L Tris-HCl缓冲液(含0.6 mol/L NaCl,pH7.2)将提取的肌原纤维蛋白配制成5 mg/mL蛋白溶液,取0.5 mL蛋白溶液加入含有4.5 mL 50 mmol/L磷酸缓冲液(含8 mol/L尿素、0.6 mol/L KCl、10 mmol/L EDTA,pH7.0)适当混匀后,加入0.5 mL 10 mmol/L DTNB,然后将混合液在25 ℃保温30 min,在412 nm下测定吸光度。每个处理组测定3次。

1.2.9 内源荧光分析 准确量取5 mg/mL的蛋白液1 mL加入9 mL磷酸盐缓冲液(50 mmol/L、pH7.0)。采用F96型荧光分光光度计测定光谱。测定条件为:激发波长290 nm,扫描范围 300～450 nm,激发狭缝宽度设置为5 nm,发射缝宽度设置为10 nm,灵敏度为3。

1.2.10 表面疏水性测定 参考Saeed等[13]的方法并加以修改。将蛋白样品用20 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(含0.6 mol/L KCl,pH7.0)稀释至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL,取上述浓度样品4 mL,再与50 μL 8 mmol/L ANS混合均匀,避光静置10 min,荧光分光光度计测定条件为:激发波长374 nm,扫描范围400～500 nm,激狭缝宽度设置为5 nm,发射缝宽度设置为10 nm,灵敏度为2。荧光强度对蛋白浓度作图所得斜率为表面疏水性。每个处理组测定3次。

1.2.11 拉曼光谱分析 参考Shao等[14]的方法,采用LabRAM HR Evolution拉曼光谱仪测量,获取的拉曼光谱在400～3600 cm-1。测试完成后用软件Labspec5对光谱进行平滑,根据苯丙氨酸环在1003 cm-1附近伸缩振动强度作为内标进行归一化。根据酰胺I带的变化,采用Alix等[15]的方法计算蛋白质二级结构(α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲)含量。并且通过对760、830、850 cm-1附近的拉曼谱带的频率和强度的变化来确定三级结构的变化。每个处理组测定3次。

1.2.12 SDS-PAGE分析 参考Xiong等[16]的方法并加以修改,用10 mmol/L Tris-HCl缓冲液(含0.6 mol/L NaCl,pH7.2)将提取的肌原纤维蛋白配制成4 mg/mL蛋白溶液,取样品溶液与样品缓冲液按1∶1 (V/V)比例混合,沸水浴15 min。制胶后(其中浓缩胶浓度4%,分离胶浓度12%),上样10 μL,初始电压80 V,待样品进到分离胶时,在120 V恒压下进行凝胶电泳实验。电泳完成后用0.25%的考马斯亮蓝染色40 min,脱色至条带清晰,最后运用Quantity One软件进行分析和处理。

1.3 数据分析

每组实验重复3次,以平均值±标准误差的方式表示。采用SPSS statistics 19.0软件使用ANOVA分析的邓肯检验进行数据显著性差异分析(P<0.05),数据绘图使用Origin 8.5软件。

2 结果与分析

2.1 臭氧水漂洗对鲅鱼鱼糜色泽的影响

表1 臭氧水漂洗对鲅鱼鱼糜色泽的影响Table 1 Effect of ozone water rinsing on the color of Spanish mackerel surimi

Zhang等[3]发现臭氧水漂洗后的鲢鱼鱼糜白度明显增加,刘慈坤[9]发现草鱼鱼糜经臭氧水漂洗后白度也有所增加,这与本研究结果较为一致。臭氧水漂洗使鱼糜白度增加主要原因是臭氧水自身的强氧化性不仅可去除多数水溶性色素,而且臭氧与水反应产生的活性氧自由基能够破坏肌红蛋白和血红蛋白的卟啉结构[18],进而去除动物血液和肌肉中的主要色素物质—血红素。由于6 mg/L臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜白度值相较对照组显著提高(P<0.05),且6、8、10 mg/L的实验组白度值之间差别不大,表明臭氧水在6 mg/L以上浓度时能较好的提高鲅鱼鱼糜白度值。

2.2 臭氧水漂洗对鲅鱼鱼糜气味特征的影响

电子鼻是一种新型电化学传感器系统,可以用于分析、识别和检测挥发性成分。PEN3电子鼻系统含有10个不同的金属氧化半导体传感器R(1)～R(10),分别对芳香族化合物、氮氧化合物、氨类、氢化物、短链烷烃、甲基化合物、无机硫化物、醇类、有机硫化物和长链烷烃具有敏感响应。由表2可知,所有传感器响应值中,对照组(0 mg/L)样品的R(2)响应值最大,其次是R(6)、R(5)、R(1)、R(3)、R(10)、R(9)、R(8)响应值。随着臭氧水浓度的增加,R(1)、R(3)、R(5)、R(6)和R(9)响应值均显著降低,表明鱼糜中芳香族化合物、氨类、短链烷烃、甲基化合物及有机硫化合物含量显著降低,而这些物质均对鱼腥味有贡献,这说明臭氧水漂洗能够有效去除鲅鱼鱼糜的鱼腥味。这一结果主要归因于臭氧的强氧化性导致许多长链有机化合物发生分解[3]。

表2 不同浓度臭氧水漂洗对鲅鱼鱼糜的电子鼻传感器响应值的影响Table 2 Effect of ozone water rinsing on electronic nose sensors response valves of Spanish mackerel surimi

主成分分析(Principal component analysis,PCA)方法可以识别各组成变量的相关性分析及主要贡献因素。对不同浓度臭氧水漂洗的鱼糜电子鼻数据进行PCA分析,由图1可知,第一主成分和第二主成分的贡献率分别达到94.43%和5.16%,总贡献为99.59%,大于85%,符合PCA 分析要求。不同浓度臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜的气味值分布在不同区域,没有相互重叠且距离较远。这表明电子鼻的主成分分析能够有效区分不同浓度臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜的气味特征,同时说明不同浓度臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜气味特征具有显著差异。

图1 不同浓度臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜的电子鼻PCA图Fig.1 PCA plot of Spanish mackerel surimi rinsed with different concentrations of ozone water

2.3 臭氧水漂洗对鲅鱼鱼糜挥发性物质的影响

为进一步验证臭氧水漂洗对鲅鱼鱼糜风味的影响,采用GC-MS对不同浓度臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜样品中挥发性物质的种类及含量进行了检测。由表3可知,所有鱼糜样品中共鉴定出36种挥发性化合物,根据它们的化学性质将其分类,包括5种醛类、1种酮类、5种醇类、3种烯烃类、2种硫醚类、3种酯类、5种芳香族化合物和12种烷烃类物质。经0、2、4、6、8和10 mg/L臭氧水漂洗后的鲅鱼鱼糜中检测到的挥发性化合物的数量分别为27、12、10、11、18和14。

表3 不同浓度臭氧水漂洗对鲅鱼鱼糜挥发性物质的影响Table 3 Effect of ozone water rinsing on the volatile compounds of Spanish mackerel surimi

随着臭氧水浓度的增加,鲅鱼鱼糜中醛类物质总含量先减少后增加。与对照组(0 mg/L)相比,2、4、6和8 mg/L臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜醛类物质总含量分别减少39.85%、49.91%、34.98%和18.21%;10 mg/L臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜中醛类物质含量比对照组增加1.86%,这可能是较高浓度臭氧水导致脂质氢过氧化物的分解和氨基酸的脱氨所致[19-20]。刘慈坤[9]发现用7或10 mg/L臭氧水处理草鱼鱼糜,壬醛和戊醛的峰面积有一定的上升。在醛类物质中己醛含量较多,各样品组己醛含量占醛类总含量的74%～75%。这一结果和李婷婷等[21]对三文鱼挥发性物质中己醛含量测定结果相似。康翠翠等[22]发现草鱼肉中己醛含量很高,其阈值为4.5 μg/g,对草鱼肉的风味形成有重要贡献。

随着臭氧水浓度的增加,鲅鱼鱼糜中醇类物质总含量先减少后增加。与对照组相比,2、4和6 mg/L臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜中醇类物质总含量分别减少43.07%、51.84%和33.65%;8和10 mg/L臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜中醇类物质比对照组增加0.14%和18.17%。饱和醇阈值高,鲅鱼鱼糜中含量少,对鱼糜气味的影响较弱;不饱和醇阈值较低,对鱼糜气味有影响。1-辛烯-3-醇的阈值很低,可以产生蘑菇气味和土腥味[23]。Iglesias等[24]发现在大西洋竹荚鱼肉中检测到1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇的含量与鱼肉脂肪的过氧化值、硫代巴比妥酸值呈现高度相关。徐永霞等[25]测定新鲜大菱鲆鱼肉中的1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇的含量明显高于腐败样品。

经过臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜中烯烃类和硫醚类物质与对照组相比明显减少。2、4、6、8和10 mg/L臭氧水漂洗后鲅鱼鱼糜中烯烃类物质分别由对照组的2.817 μg/g,降为0.252、0.101、0.084、0.257和0.518 μg/g。烯烃类物质经氧化后可能产生醛类和酮类物质。二甲基二硫和二甲基三硫是鱼肉中主要含硫化合物。Qian等[26]发现太平洋鳕鱼和阿拉斯加鳕鱼鱼肉中含有丰富的二甲基三硫。硫醚类物质的减少和电子鼻的检测中有机硫挥发物的响应值降低保持一致。

经过臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜中酯类与对照组相比明显减少。酯类物质大多具有水果香味,本研究检测到的酯类物质含量很少,对鱼糜气味影响较小。2 mg/L以上浓度臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜未检测到芳香类物质。2、4 mg/L臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜中烷烃类物质很少;与对照组相比,6、8和10 mg/L臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜中烷烃物质分别减少70.68%、71.36%和67.42%。烷烃类物质气味阈值高,对鱼糜气味影响很小。

总体来看,一定浓度的臭氧水漂洗能有效地降低鲅鱼鱼糜中鱼腥味物质的种类和含量,有助于改善鱼糜的整体风味,这与电子鼻分析结果基本一致。臭氧水对挥发性化合物的脱除作用可能归因于臭氧水对其直接分解作用,也可能与臭氧破坏肌肉蛋白质与挥发性物质的结合作用有关。鱼糜漂洗过程中,臭氧的强氧化作用一定程度上引发鱼糜蛋白质氧化修饰,导致蛋白质的结构性质发生改变,进一步影响风味物质-蛋白质之间的相互作用。为验证该假说,接下来对臭氧水漂洗后鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白的氧化情况进行了分析。

2.4 臭氧水漂洗对鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白羰基和总巯基含量的影响

氨基酸侧链基团直接氧化成羰基衍生物是蛋白质氧化的主要途径[27]。许多氨基酸侧链基团容易被氧化剂修饰成羰基衍生物,因此,羰基已经被广泛应用与评估蛋白质氧化修饰程度[28]。由图2可知,随着臭氧水浓度的增加,肌原纤维蛋白羰基含量有显著增加的趋势。与对照组相比,2和4 mg/L的臭氧水漂洗鲅鱼鱼糜的肌原纤维蛋白羰基含量增加不显著(P>0.05);6、8、10 mg/L的臭氧水漂洗鲅鱼鱼糜的肌原纤维蛋白羰基含量比对照组显著增加25.63%、54.12%、62.03%(P<0.05)。这说明臭氧水漂洗鲅鱼鱼糜能导致其肌原纤维蛋白氨基酸侧链的氧化生成羰基衍生物。Zhang等[7]发现臭氧水漂洗后鳙鱼鱼糜的羰基含量显著增加,与本研究结果一致。

图2 臭氧水漂洗对鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白羰基和总巯基含量的影响Fig.2 Effect of ozone water rinsing on the carbonyl content and total sulfhydryl group content of myofibrillar proteins in Spanish mackerel surimi注:不同大写字母代表各处理组间总巯基含量差异显著,P<0.05;不同小写字母代表各处理组间羰基含量差异显著,P<0.05。

由于半胱氨酸对氧化环境有较高的灵敏性,因此巯基含量的变化也常被用作蛋白质氧化的标志[28]。由图2可知,随着臭氧水浓度的增加,肌原纤维蛋白总巯基含量总体呈降低趋势。与对照组相比,2、6、8和10 mg/L臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白总巯基含量分别降低8.26%、11.69%、21.81%、21.36%(P<0.05)。Zhang等[2]用3.3和5.1 mg/L臭氧水漂洗鳙鱼鱼糜20 min后,与对照组(0 mg/L漂洗)相比,测定的肌原纤维蛋白总巯基含量没有显著变化(P>0.05);然而,用7.6 mg/L臭氧水漂洗鲢鱼鱼糜20 min后,相较于对照组总巯基含量显著减少(P<0.05)。李学鹏等[30]研究发现在4 ℃冷藏的大菱鲆鱼肉肌原纤维蛋白总巯基含量呈降低趋势,并推测与巯基氧化有关。本研究中总巯基含量的减少可能与臭氧和水反应产生的·HO2和·OH有关,这些自由基导致巯基氧化形成了二硫键。高浓度臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白的总巯基含量显著下降,羰基含量显著增加(P<0.05)。

2.5 臭氧水漂洗对鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白色氨酸内源荧光强度的影响

多肽和蛋白质中的芳香族氨基酸,如酪氨酸、色氨酸、组氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸残基容易被氧化修饰[5],进而改变蛋白质的内源荧光特性。其中,色氨酸荧光最强,是最容易被·OH、1O2和O3氧化修饰的氨基酸之一,因此内源性色氨酸荧光通常用作检测蛋白质构象变化的标记物[5,31-32]。由图3可知,鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白在335 nm处有最大荧光吸收。与对照组相比,2、4 mg/L臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白内源荧光强度有少许降低;6、8和10 mg/L臭氧水处理组内源荧光强度明显减少。内源荧光强度的降低可能是臭氧的强氧化性破坏了肌原纤维蛋白的构象,导致蛋白质发生去折叠和展开,色氨酸残基暴露在极性环境中,并发生一定程度的荧光猝灭。李学鹏等[33]发现羟基自由基氧化的草鱼肌原纤维蛋白的内源荧光强度,随着H2O2浓度的增加而显著降低。随着臭氧水浓度的增加,肌原纤维蛋白内源荧光强度呈显著降低趋势。

图3 不同浓度臭氧水漂洗对鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白色氨酸内源荧光强度的影响Fig.3 Effect of ozone water rinsing on the tryptophan endogenous fluorescence of myofibrillar proteins in Spanish mackerel surimi

2.6 臭氧水漂洗对鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

蛋白质的表面疏水性可用来评价蛋白质构象变化[34]。在紫外光照射下,荧光探针ANS和肌原纤维蛋白质疏水性残基结合后能发生强荧光效应,利用此原理测定肌原纤维蛋白表面疏水性灵敏度较高。由图4可知,随着臭氧水浓度的增加,肌原纤维蛋白表面疏水性指数先增加后减少。与对照组相比,4、6和8 mg/L臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白表面疏水性指数显著增加了10.99%、10.06%和10.09%(P<0.05),而10 mg/L臭氧水漂洗样品表面疏水性指数又略有下降。这一结果可能是较低浓度臭氧水处理导致鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白分子内部的疏水性基团暴露,导致疏水性结合位点增加;而过高浓度的臭氧水导致肌原纤维蛋白分子的疏水性基团过度暴露,疏水相互作用增强,疏水性基团相互吸引,从而遮盖一些疏水性结合位点,使疏水性降低。Duan等[35]发现温和氧化导致蛋清蛋白的疏水性基团暴露,而过度氧化导致蛋清蛋白的表面疏水性减低。臭氧水漂洗可能导致鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白分子内部疏水基团暴露,增强蛋白分子间的疏水相互作用。

图4 不同浓度臭氧水漂洗对鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白表面疏水性指数的影响Fig.4 Effect of different contents of ozone water rinsing on the hydrophobicity of myofibrillar proteins in Spanish mackerel surimi注:不同小写字母代表各处理组间表面疏水性指数差异显著,P<00.05。

2.7 臭氧水漂洗对鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白二级结构的影响

拉曼光谱是振动光谱,可以反映二硫键、氢键等重要化学键的相关信息,也可以显示蛋白肽链骨架、侧链所处的微观环境等化学信息。蛋白质主链中的酰胺Ⅰ(1600～1700 cm-1)和酰胺Ⅲ(1200～1350 cm-1)是重要的拉曼谱带,常被用来分析和定量蛋白质的二级结构[36]。拉曼光谱图一般由苯丙氨酸的特征峰1003 cm-1附近的谱带归一化得到。不同浓度臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白拉曼光谱如图5 所示,采用Alix公式计算不同处理组的蛋白二级结构含量如表4所示。

图5 不同浓度臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白拉曼光谱图Fig.5 Raman spectrum of myofibrillar proteins in Spanish mackerel surimi rinsed treated by different concentration of ozone water

由表4可以看出,经过臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白二级结构发生了变化。与对照组(0 mg/L)相比,2、4、6和8 mg/L臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白二级结构α-螺旋含量随臭氧水浓度增加而显著减少(P<0.05),β-折叠、β-转角、无规则卷曲含量则显著增加(P<0.05);而10 mg/L臭氧水漂洗后鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白二级结构α-螺旋含量略有增加,β-折叠、β-转角、无规则卷曲含量略有减少。这说明臭氧水漂洗引起鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白构象发生变化,α-螺旋逐渐转变为β-折叠等,蛋白结构稳定性也随之下降。Jiang等[8]用臭氧氧化肌球蛋白发现随着臭氧氧化时间的增加,肌球蛋白α-螺旋含量减少,β-折叠、β-转角、无规则卷曲含量增加。

表4 不同浓度臭氧水漂洗对鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白的二级结构的影响Table 4 Effect of ozone water rinsing on the secondary structures of myofibrillar proteins in Spanish mackerel surimi

在拉曼光谱中760 cm-1附近的条带,可以表明色氨酸残基的伸缩振动的变化。色氨酸残基从蛋白分子内部疏水环境暴露到极性亲水环境,拉曼光谱中760 cm-1附近的条带峰值降低[37]。与对照组相比,经过臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白的I760/I1003值显著降低,这表明色氨酸残基从蛋白分子内部暴露到极性亲水环境,与色氨酸内源荧光的分析结果一致。

酪氨酸双峰比值(I850/I830)可用于鉴定酪氨酸残基微环境的变化,如酪氨酸残基的暴露或包埋。当酪氨酸残基暴露时,在850 cm-1处的峰值高于830 cm-1处的峰值;当酪氨酸包埋在蛋白分子内部时,在850 cm-1处的峰值低于830 cm-1处的峰值[38]。与对照组比较,经过臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白的I850/I830值明显增加,表明臭氧水漂洗使鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白酪氨酸残基暴露于极性环境。臭氧水漂洗导致鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白二级结构α-螺旋降低,β-折叠、β-转角、无规则卷曲含量增加,色氨酸残基和酪氨酸残基从蛋白分子内部疏水环境暴露到亲水环境。

2.8 臭氧水漂洗对鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白交联和聚集的影响

凝胶电泳可以分析不同浓度臭氧水漂洗后鱼糜肌原纤维蛋白亚基的结构变化。图6显示了未还原和β-巯基乙醇还原状态下不同处理鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白的SDS-PAGE图谱。由6a图可知,随着臭氧水浓度的增加,肌球蛋白重链(Mysion heavy chain,MHC)条带减弱,分离胶顶端>200 kDa蛋白聚集体明显增多。经过β-巯基乙醇还原后蛋白形成的>200 kDa蛋白聚集体消失,肌球蛋白重链、肌动蛋白(Actin)的条带颜色加深(图6b)。该结果表明臭氧水处理导致鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白分子之间发生了一定程度的交联和聚集,形成分子质量大的聚集体,这种交联和聚集现象主要归因于蛋白质氧化形成的二硫键作用。此外,SDS-PAGE图中未发现明显的蛋白质降解片段,这说明臭氧水漂洗引起的氧化对鱼糜肌原纤维蛋白没有明显降解作用。Zhang等[2]用臭氧水漂洗鲢鱼鱼糜,电泳结果表明肌原纤维蛋白也没有发生降解。

图6 不同浓度臭氧水漂洗的鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白SDS-PAGE图Fig.6 SDS-PAGE of myofibrillar proteins in Spanish mackerel surimi rinsed with different concentration of ozone water注:a:未加β-巯基乙醇;b:加β-巯基乙醇;M:标准蛋白;MHC:肌球蛋白重链;Actin:肌动蛋白。

3 结论

经过臭氧水漂洗后鲅鱼鱼糜的亮度和白度值增加,色泽得到改善;鲅鱼鱼糜的挥发性气味发生改变,鱼糜中醛类、醇类、烯烃类、硫醚类、烷烃类等挥发性物质含量减少。鲅鱼鱼糜因为白度低和腥味重导致其食用价值受限,利用臭氧水漂洗有助于改善鲅鱼鱼糜的色泽和风味进而提高其食用价值。另外,臭氧水漂洗后的鲅鱼鱼糜肌原纤维蛋白发生了一定程度的氧化,并引起蛋白质结构和构象的变化。但是,这种氧化对鲅鱼鱼糜的凝胶特性和营养价值的影响还未被了解有待深入研究。