抗氧化剂对赖氨酸-葡萄糖反应生成羧甲基赖氨酸的抑制研究*

豆康宁，华向美，黄亚男，李盘欣，韩文凤，石 晓，王 飞

（1.漯河医学高等专科学校河南省休闲食品工程技术研究中心，河南 漯河 462002；2.漯河出入境检验检疫局，河南 漯河 462002；3.河南南街村（集团）有限公司，河南 漯河 462600；4.漯河职业技术学院，河南 漯河 462002）

食品中 Nε-(1-羧甲基)-L-赖氨酸（Nε-(1-Carboxyethyl)-L-Lysine）简称羧甲基赖氨酸或CML，是晚期糖基化终末产物中最主要代表之一[1]，对人体健康具有一定危害，如能促进人体器官的衰老，肾病、动脉粥样硬化等疾病的发展[2]。羧甲基赖氨酸普遍存在于食品中，如烘焙食品、方便面、酱油等[3]。因此，研究抑制羧甲基赖氨酸的生成，对提高食品的质量与安全具有重要价值。研究发现，抗氧化剂对食品中羧甲基赖氨酸的生成具有抑制作用[4]，该文研究了具有抗氧化性的抑制剂维生素B1、维生素B6、儿茶素、白藜芦醇、丁基羟基茴香醚（BHA）、叔丁基对苯二酚（TBHQ）对赖氨酸-葡萄糖生成羧甲基赖氨酸的抑制作用，为食品中羧甲基赖氨酸的控制提供技术借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羧甲基赖氨酸(CML)标准品：色谱纯，加拿大TRC公司；甲醇、甲酸：色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；水:一级纯水；维生素B1、维生素B6、儿茶素、白藜芦醇、BHA、TBHQ：含量 98%，南京纳满生物科技有限公司；葡萄糖、L-赖氨酸，色谱纯，sigma公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硼酸钠、硼氢化钠以及三氟乙酸，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Waters-XevoTQ型液相色谱串联质谱仪、Waters ACQUITY UPLC-BEH Amide型色谱柱，美国Waters公司；YP3001N型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；DKU-3型油浴锅，上海精宏实验设备有限公司；SPE固相萃取小柱，沃特世科技(上海)有限公司，LGJ-18B型冷冻干燥机，北京亚泰科隆仪器技术有限公司。

2 试验方法

2.1 赖氨酸-葡萄糖美拉德模拟反应及抑制体系的建立

用50 mmol/L，pH 7.4磷酸盐缓冲液配制浓度为0.3 mol/L的赖氨酸-葡萄糖的反应液，然后按照质量百分比添加1%、2%、5%、10%、20%的维生素B1、维生素B6、儿茶素、白藜芦醇、丁基羟基茴香醚、叔丁基对苯二酚，在100℃油浴条件下加热20 min后取出各反应管，冷却后备用。

2.2 羧甲基赖氨酸检测样品前处理

参考Jialiang等[5]以及 Maria等[6]报道的方法，对2.1反应所得的样品进行处理，得HPLC-MS检测样品。具体步骤参考文献[7]中LC-MS/MS法测定CML及CEL含量。

2.3 HPLC-MS检测条件

流动相：0.1%甲酸:甲醇=7:3，流动相流速为0.5 mL/min，柱温为25℃，进样量为10 μL，运行时间为10 min。质谱条件：离子源温度为100℃，脱溶剂温度为300℃，锥孔电压为20 eV，锥孔气体流速为50 L/h，脱溶剂气体流速为350 L/h，载气为氮气。选择性离子监测（SIR）：羧甲基赖氨酸准分子离子质荷比m/z 205，离子碎片质荷为m/z 130和m/z 84。

2.4 羧甲基赖氨酸标准曲线测定方法

分别制备浓度为 5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL的羧甲基赖氨酸溶液，然后测定响应值，建立羧甲基赖氨酸浓度与响应值之间的关系曲线。

2.5 添加剂对羧甲基赖氨酸抑制率的计算

赖氨酸-葡萄糖模拟体系中羧甲基赖氨酸含量的计算公式如下：

X为抑制率；CML为羧甲基赖氨酸。

2.6 数据分析

以上所有实验方法中涉及的实验数据均做平行试验2次，使用SPSS 18.0数理统计分析软件进行统计分析。

3 实验结果

3.1 羧甲基赖氨酸标准曲线

浓度为 5ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL的羧甲基赖氨酸溶液的液质色谱响应值R分 别 为 5 153.81、1 010 168.38、18 670.31、37853.33、73 945.83，所建立的曲线方程为 Y=916.97X+732.36，相关系数 R=0.9998。

图1为羧甲基赖氨酸标准品液质色谱出峰图，出峰时间范围为4.67～4.69 min。图2为羧甲基赖氨酸特征离子峰，羧甲基赖氨酸的特征离子质荷比为205、130、84。图3为赖氨酸-葡萄糖模拟体系液质色谱出峰图。

图1 羧甲基赖氨酸标准品液质色谱出峰图

图2 羧甲基赖氨酸的质谱特征离子峰

图3 赖氨酸-葡萄糖反应产物液质色谱出峰图

3.2 维生素类添加剂对羧甲基赖氨酸的抑制率

在赖氨酸-葡萄糖的反应液中，按照质量百分比分别添加 1%、2%、5%、10%、20%的维生素 B1、维生素B6，维生素B1、维生素B6对羧甲基赖氨酸的抑制率见图4所示。

图4 维生素类添加剂对羧甲基赖氨酸的抑制率

从图4可知，随着维生素B1、维生素B6添加量的增加，羧甲基赖氨酸的抑制率逐渐增加，当添加量为20%时，维生素B1的抑制率为21.46%，维生素B6的抑制率为9.37%，维生素B1的抑制效果比维生素B6效果好。刘荟萃[8]研究了维生素B1对油炸麻花中羧甲基赖氨酸具有抑制作用。维生素B1抑制羧甲基赖氨酸的机理，作用方式是通过清除美拉德反应生成的活性羰基化合物，进而抑制了羧甲基赖氨酸的形成[9-10]。

3.3 多酚类添加剂对羧甲基赖氨酸的抑制率

在赖氨酸-葡萄糖的反应液中，按照质量百分比分别添加1%、2%、5%、10%、20%的儿茶素、白藜芦醇，儿茶素、白藜芦醇对羧甲基赖氨酸的抑制率见图5所示。

图5 多酚类添加剂对羧甲基赖氨酸的抑制率

从图5可知，随着儿茶素、白藜芦醇添加量的增加，羧甲基赖氨酸的抑制率逐渐增加，当添加量为20%时，儿茶素的抑制率为10.95%，白藜芦醇的抑制率为13.68%，白藜芦醇的抑制效果比儿茶素抑制效果好。刘慧琳等[11]研究了6种多酚类物质对羧甲基赖氨酸的抑制研究，结果显示白藜芦醇的抑制作用最大。周燕琼[12]研究发现儿茶素对曲奇饼干中羧甲基赖氨酸的生成具有良好的抑制作用。Rice-E-vans等[13]研究发现多酚类化合物通过抑制葡萄糖的自氧化反应和清除自由基等方式抑制羧甲基赖氨酸的形成。儿茶素、白藜芦醇为多酚类抗氧化剂，具有抑制羧甲基赖氨酸生成作用。

3.4 化学合成抗氧化剂对羧甲基赖氨酸的抑制

在赖氨酸-葡萄糖的反应液中，按照质量百分比分别添加 1%、2%、5%、10%、20%的 BHA、TBHQ，BHA、TBHQ对羧甲基赖氨酸的抑制率见图6所示。

图6 化学合成抗氧化剂对羧甲基赖氨酸的抑制率

从图6可知，BHA、TBHQ对羧甲基赖氨酸的生成具有促进作用，也即抑制率为负值，抑制率越小，促进作用越大。随着BHA、TBHQ添加量的增加，羧甲基赖氨酸的抑制率逐渐减小，当BHA、TBHQ添加量为20%时，BHA的抑制率为-2.49%，TBHQ的抑制率为-42.13%。这说明BHA对羧甲基赖氨酸的促进作用较小，而TBHQ对羧甲基赖氨酸的促进作用较大。付如意[14]研究发现，在食品模拟体系中，具有抗氧化性的维生素C、维生素E对羧甲基赖氨酸无抑制效果。刘红[15]研究了4种抗氧化剂BHA、BHT、TBHQ、Vc对多种美拉德模拟体系反应的影响，4种抗氧化剂对甘氨酸-葡萄糖体系有显著影响，对天冬酰胺-葡萄糖体系无显著影响。因此，有的抗氧化剂具有抑制羧甲基赖氨酸的生成作用，而有的却没有，有的甚至还具有促进生成作用。

4 结论

维生素类抗氧化剂维生素B1、维生素B6和多酚类抗氧化剂儿茶素、白藜芦醇对赖氨酸-葡萄糖生成羧甲基赖氨酸具有抑制作用，抑制率从大到小的顺序依次为维生素B1、白藜芦醇、儿茶素、维生素B6；化学合成抗氧化剂BHA、TBHQ对赖氨酸-葡萄糖生成羧甲基赖氨酸具有促进作用，BHA促进作用较小、TBHQ促进作用较大。有的抗氧化剂具有抑制羧甲基赖氨酸的生成作用，而有的却没有，有的甚至还具有促进生成作用，其原因有待进一步探明。