超声辅助碱醇提取青麦仁中阿魏酸的工艺研究*

张康逸，杨 妍，康志敏*

（河南省农业科学院农副产品加工研究中心，郑州 450008）

青麦仁是由已经长饱满但未成熟的小麦粒速冻而成，几乎保留了青麦中全部的天然营养成分，以淀粉为主，并含有阿魏酸、黄酮类化合物等多种抗肿瘤、抗氧化等生物活性成分[1-2]。河南省作为小麦的主产省份，每年向市场提供的商品小麦占全国产量的1/3。全谷物中阿魏酸的含量较高[3]，从青麦仁中提取分离阿魏酸，并研发具有保健作用的功能性产品，不但能增加青麦仁的经济价值，并且可以使我国种植面积丰富的小麦作物得以充分的开发和利用。

阿魏酸作为国际公认的天然抗氧化剂，是一种存在于植物细胞壁中的酚酸，具有清除氧自由基、降血脂、抗血小板聚集和血栓形成、抗突变、防癌及增加免疫等生理功能[4-5]，在食品、保健品、医药和化妆品等领域都有广泛的应用[6-7]。阿魏酸还是天然、安全的自由基淬灭剂和抗氧化剂，几乎无毒性作用。清除DPPH自由基、羟自由基、ABTS自由基、超氧阴离子的能力及还原能力是评价某种物质抗氧化活性的常用指标[8-9]。近年来，国际上常见的抗氧化剂多为人工合成酚类物质，如BHT（2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚）、TBHQ（特丁基对苯二酚）和BHA（丁基羟基茴香醚）等，但由于毒性和致癌作用，BHA和BHT已被相关机构限制使用[10]。因此，寻找安全无毒副作用的天然抗氧化剂是目前的研究热点。

阿魏酸的提取方法主要包括：有机溶剂法、碱法、微波辅助提取法及超声辅助提取法等[11-12]，其中超声辅助提取法利用其产生的机械振动、空化效应、热效应等物理作用粉碎植物细胞壁，能够增加细胞壁通透性从而缩短提取时间提高效率，已被广泛应用于许多领域，尤其是医药行业的中药提取[13]。由于青麦仁中的阿魏酸主要通过酯键与细胞壁多糖和木质素交联结合，因此本研究首先采用淀粉酶和蛋白质酶对青麦仁中的淀粉和蛋白质进行酶解，然后采用超声辅助碱醇提取青麦仁中的阿魏酸，优化提取条件仪器获得较高产率和纯度的阿魏酸，并通过DPPH自由基、羟自由基、ABTS自由基、超氧阴离子及还原能力等五项指标对青麦仁中阿魏酸的抗氧化能力进行评估，进一步了解其抗氧化活性，以期为天然抗氧化剂的研究及产业化开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂

青麦仁 （河南省农科院农副产品加工研究所提供），阿魏酸、碱性蛋白酶（20万 u/g）：上海源叶生物科技有限公司；α-淀粉酶（4万 u/mL）：江苏锐阳生物科技有限公司；DPPH （1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS+（3-乙基苯并噻唑磷）：阿拉丁试剂公司。盐酸、亚铁氰化钾、硫酸锌、甲基红、溴甲酚绿、95%乙醇、硼酸等试剂均为国产分析纯。

1.1.2 实验仪器

紫外可见分光光度计：上海翱艺仪器有限公司；全自动凯氏定氮仪：海能仪器；自动旋光仪：上海精密科学仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；恒温水浴锅：精骐有限公司；常温低速离心机：安徽嘉文仪器设备有限公司；超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；多功能粉碎机：上海兆申科技有限公司。

1.2 阿魏酸的制备工艺流程

1.2.1 工艺流程

青麦仁→干燥后粉碎→淀粉酶、蛋白酶预处理→灭酶→碱醇法提取→离心、调pH，定容→静置1h→分光光度测定

1.2.2 淀粉酶和蛋白酶预处理

准确称取10 g制备好的青麦仁粉，加入100 mL蒸馏水，加入一定量的α-淀粉酶，放入70℃水浴锅中反应30 min。待温度降至50℃，用1 mol/L NaOH溶液调节pH值至9，加入一定量的碱性蛋白酶，水解2 h。加热至100℃灭酶10 min。快速降温后4000 r/min离心20 min，将用蒸馏水冲洗2次后的沉淀物放入80℃烘箱中，即为去除淀粉和蛋白的粗纤维，待测备用。

1.2.3 淀粉含量的测定

采用旋光测定法检测[14]。准确称取2.5 g青麦仁粉于烧杯中，加入50 mL 1%盐酸溶液，轻摇混匀后将烧杯置于沸水浴中，加热15 min即刻取出降至室温。加入1 mL 30%硫酸锌溶液，震荡后再加入1mL 15%亚铁氰化钾溶液，稀释定容至100 mL，用旋光仪检测。按照下列公式（1）计算：

式中：α为测得的旋光度；[α]D20为淀粉的比旋光度；L为旋光管长度,dm；W为样品重量，g。

1.2.4 蛋白质含量的测定

采用凯氏定氮法检测[15]。称取1.5 g青麦仁粉放入消化管中，依次加入凯氏定氮催化片和10 mL浓硫酸，设置不同温度和时间进行消化。待冷却至100℃后进行滴定，设置样品质量和空白体积，硼酸15 mL，稀释液10 mL，碱液40 mL，蒸馏时间5 min，所得结果即为蛋白质含量（质量分数）。

1.3 分光光度法测定阿魏酸

1.3.1 制定阿魏酸标准曲线

精确称取阿魏酸标准样品10 mg，用95%乙醇定容至100 mL，再逐个加入蒸馏水配置质量浓度分别为 0.001 mg/mL、0.002 mg/mL、0.003 mg/mL、0.004 mg/mL的一系列标样溶液，使用紫外分光光度计于322 nm处测定吸光值，阿魏酸标准曲线为y=0.1258+64x，R2=0.9923，标准曲线如图 1。

式中：y为吸光度；x为阿魏酸溶液浓度。

1.3.2 青麦仁中阿魏酸的测定

将上述1.2提取工艺中制备的待测品5 mL稀释至10 mL，加入9 mL 95%乙醇中，混匀，用紫外分光光度计于322 nm处测定吸光值，进行3次平行测定，利用标准曲线计算阿魏酸的提取量。

1.4 提取工艺的单因素实验

1.4.1 料液比对阿魏酸提取量的影响

图1 阿魏酸标准曲线

称取预处理的青麦仁粉10 g，在碱液质量浓度为4 g/100 mL，温度为60℃，碱醇比为2:1，超声功率为 240 W 的条件下，选择 1:10、1:15、1:20、1:25、1:30（w/v）的料液比，提取30 min，测定阿魏酸提取量。

1.4.2 超声温度对阿魏酸提取量的影响

称取预处理的青麦仁粉10g，在碱液浓度为4 g/100 mL，料液比为 1:15（w/v），碱醇比为 2:1(v/v)，超声功率为 240 W 的条件下， 选取 40、50、60、70、80℃5个不同温度，提取30 min，测定阿魏酸提取量。

1.4.3 碱醇比对阿魏酸提取量的影响

称取预处理的青麦仁粉10 g，在碱液浓度为4 g/100 mL，料液比为1:15，温度为60℃，超声功率为240 W 的条件下， 选择 1:1、1:2、2:1、1:3、3:1 (v/v)5个不同的碱醇比，提取30 min，测定阿魏酸提取量。

1.4.4 超声时间对阿魏酸提取量的影响

称取预处理的青麦仁粉10 g，在碱液浓度为4g/100 mL，料液比为 1:15（w/v），温度为 60 ℃，碱醇比为 2:1， 超声功率为 240 W， 选择 15、30、45、60、75 min不同超声时间提取，测定阿魏酸的提取量。

1.4.5 NaOH浓度对阿魏酸提取量的影响

称取预处理的青麦仁粉10 g，在料液比为1:15（w/v），温度为 60 ℃，碱醇比为 2:1(v/v)，超声功率为240 W 的条件下， 选择 0.5、1、2、4、8 g/100 mL 不同碱液浓度，提取45 min，测定阿魏酸的提取量。

1.4.6 超声功率对阿魏酸提取量的影响

称取预处理的青麦仁粉10 g，在碱液浓度为4g/100 mL，碱醇比为 2:1，料液比为 1:20（w/v），温度为60 ℃条件下，选择 360、420、480、540、600 W 不同超声功率，提取45 min，测定阿魏酸的提取量。

1.5 超声辅助碱醇提取青麦仁中阿魏酸的正交试验

在上述单因素实验结果的基础上，选择对阿魏酸提取量影响较大的四个主要因素：超声温度（A）、NaOH 质量浓度（B）、碱醇比（C）、超声功率（D）采用L9（34）进行正交实验设计，各组实验重复3次，确定最佳工艺参数。正交试验设计见表1。

表1 正交试验因素水平

1.6 体外抗氧化能力测定

1.6.1 DPPH自由基清除率检测

参照文献16的方法，取2 mL（0.1 mol/L）的DPPH溶液分别加入不同浓度的待测提取液入试管中，充分混合后避光反应20 min，于517 nm处测定吸光度Ai；以无水乙醇代替 DPPH，测吸光度Aj；空白组以蒸馏水代替待测液，测吸光度A0。以Vc为阳性对照，各组均重复测3次，按以下公式取平均值计算清除率 I。

1.6.2 羟 除率的检测

取浓度的待测提取液，依次加入2 mL（6 m亚铁、2 mL（6 mol/L）H2O2，混匀后静置10加入2 mL（6 mol/L）水杨酸，混匀后静置510 nm处测吸光值Ai。以蒸馏水代替水 值Aj，空白对照以2 mL蒸馏水代替青 取液吸光值A0。以Vc为阳性对照，各组 次，按以下公式取平均值计算清除率 E。

1.6.3 ABTS自由基清除率的检测

将 ABTS（7 mol/L）与 K2S2O8（2.45 mol/L）按 1:1比例混合，密封后避光静置过夜，用无水乙醇稀释40～50倍，调整混合液吸光值734 nm下在0.68～0.72之间。取25 μL待测提取液与2 mL ABTS工作液混合振荡10 s，室温静置5 min后于734 nm下检测吸光值Ai，以无水乙醇代替待测提取液作为空白对照，测吸光值A0。以Vc为阳性对照，各组均重复测3次，按以下公式取平均值计算清除率W。

1.6.4 超氧阴离子清除率的测定

2 结果与分析

2.1 α-淀粉酶的用量测定

由图2可知，随着淀粉酶添加量的增加，青麦仁粉中的淀粉含量呈下降趋势，当淀粉酶含量为0.04 mL时，青麦仁粉中淀粉的含量 （质量分数）为8.56%；当加酶量超过0.04 mL时，随着加酶量的增加，淀粉酶的含量变化趋于平缓。

图2 淀粉酶添加量对酶解效果的影响

2.2 蛋白酶的用量测定

由图3可知，随着蛋白酶添加量的增加，青麦仁粉中的蛋白质含量逐渐减少。当蛋白酶用量为0.1 g时，青麦仁粉中的蛋白质含量 （质量分数）降至10.87%，当蛋白酶添加量超过0.1 g时，蛋白质含量的变化不大。

图3 蛋白酶添加量对酶解效果的影响

2.3 单因素实验

2.3.1 料液比对阿魏酸提取量的影响

由图4可知，当料液比低于1:15（w/v）时，阿魏酸的提取量随着料液比的增加迅速增高；但当料液比高于1:15（w/v）时，阿魏酸的提取量则逐渐下降。因为阿魏酸在青麦仁中是以酯键与细胞壁多糖和木质素交联的，适量的碱液可破坏酯键，加速溶解分离阿魏酸，但碱液量过大易导致其它可溶物析出，造成阿魏酸提取率的降低，不利于后期分离。因此，选择1:15（w/v）为最佳料液比。

图4 料液比对阿魏酸提取量的影响

2.3.2 超声温度对阿魏酸提取量的影响

由图5可知，随着温度的升高，阿魏酸的提取量逐渐增加，并于80℃时达到最大值，继续升高温度其提取量明显下降。因为阿魏酸不耐高温，当温度高于80℃，一方面由于释放的阿魏酸会被中和，另一方面体系中的阿魏酸因热作用使其结构发生改变或与其他物质化合，造成溶液中阿魏酸活性降低[17]。也有可能是温度过高导致反应液粘度增加，造成阿魏酸提取困难。因此，选择80℃为最佳超声提取温度。

图5 超声温度对阿魏酸提取量的影响

2.3.3 碱醇比对阿魏酸提取量的影响

由图6可知，当碱醇比低于2:1(v/v)时，未能充分游离释放出细胞壁中酯键交联的阿魏酸，故而提取量不高；但碱醇比过高，使得提取时发生皂化反应并增加提取液粘度，使得阿魏酸未能及时溶解于乙醇中，用乙酸乙酯萃取时易发生乳化现象，造成阿魏酸提取量降低。因此，选择2:1(v/v)为最佳碱醇比。

图6 碱醇比对阿魏酸提取量的影响

2.3.4 超声时间对阿魏酸提取量的影响

由图7可知，当提取时间为45 min时得到的阿魏酸提取量最高。但随着时间的延长，超声波产生的空化效应作用力减弱，使得青麦仁表面对阿魏酸的吸附力增强，进而降低阿魏酸的提取量；另一方面，因时间延长使得阿魏酸暴露在空气中被氧化分解，造成阿魏酸的提取量逐渐降低。因此，选择45 min为最佳提取时间。

图7 超声时间对阿魏酸提取量的影响

2.3.5 NaOH碱液浓度对阿魏酸提取量的影响

由图8可知，当 NaOH碱液浓度为4 g/100 mL时，碱液可破坏交联的酯键，使阿魏酸释放游离，得到的阿魏酸提取量为最高值；但随着 NaOH碱液浓度的逐渐增加，青麦仁中的纤维素发生水解作用影响阿魏酸的提取；另外，碱液浓度的升高造成提取液粘度也随之增大、过滤、离心效果均不佳，造成其提取量明显降低。因此，选择4 g/100 mL为最佳NaOH碱液浓度。

图8 碱液浓度对阿魏酸提取量的影响

2.3.6 超声功率对阿魏酸提取量的影响

由图9可知，超声功率在360～480 W之间，随着超声功率的增加，阿魏酸提取量逐渐增加；当超声功率高于480 W时，导致阿魏酸不稳定而发生分解，使得其提取量开始下降。因此，选择480 W为最佳超声功率。

图9 超声功率对阿魏酸提取量的影响

2.4 阿魏酸提取工艺正交优化

由以上单因素实验结果作为参考，选取4个影响较大的因素：提取温度（A）、NaOH 碱液浓度（B）、碱醇比（C）、超声功率（D）4 个因素，采用四因素三水平L9（34）进行正交实验设计，每个实验重复3次，以阿魏酸提取量为指标，确定最佳工艺，结果见表2所示。

表2 正交试验设计及结果

从表2中 R值可以看出，各因素影响显著程度大小为：A＞B＞D＞C，最佳组合为 A2B2C1D1，即提取温度80℃、NaOH碱液浓度6 g/100 mL、碱醇比1:2(v/v)、超声功率480 W。在最优组合条件下进行3次平行验证实验，阿魏酸提取量为（2.85±0.15）mg/g青麦仁粉。

3 结论与讨论

本实验采用超声辅助碱醇法提取青麦仁中的阿魏酸，首先采用淀粉酶和蛋白质酶去除青麦仁中的淀粉和阿魏酸时，酶解2.5 g青麦仁需用 α-淀粉酶0.04 mL，可使淀粉含量百分数降至8.56%；碱性蛋白酶的用量为0.1 g时，蛋白质含量百分数降至10.87%。超声辅助碱醇最佳提取工艺参数为提取温度80℃、NaOH碱液浓度6 g/100 mL、碱醇比1:2、超声功率480 W的条件下，提取量可达（2.85±0.15）mg/g。此工艺条件可用于以青麦仁为原料制备天然阿魏酸。