参威骨痹片质量标准及药效学研究

李江 陈凌云 陈坤 付鹏 彭霜 李娇 余晓玲

摘要：目的 建立本品质量标准并考察其对骨关节炎模型大鼠膝关节液TNF-α的影响。方法 采用显微照相系统对当归、川芎、桂枝进行显微鉴别;采用TLC法对桂枝、熟地、秦艽进行薄层鉴别;采Kedde反应对强心苷进行限量检查;采用多波长-HPLC法同时对马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷进行含量测定;采用ELISA法测定骨关节炎模型大鼠关节液中的TNF-α。结果 显微鉴别特征较易见;TLC法可检出上述药味，且阴性无干扰;强心苷含量在安全范围内;马钱苷酸、龍胆苦苷、芍药苷平均含量分别为174.04、207.73、280.45 μg/g（n=6）;与正常组相比模型组大鼠膝关节TNF-α水平显著升高（P<0.001），与模型组相比参威骨痹片高、低剂量组显著降低（P<0.01）。结论 所建标准可用于本品质量控制，参威骨痹片对膝关节炎模型大鼠关节液TNF-α有抑制作用。

关键词：参威骨痹片;质量标准;显微鉴别;TLC鉴别;强心苷检查;马钱苷酸;龙胆苦苷;芍药苷;关节炎;肿瘤坏死因子

中图分类号：R927.11 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2020）06-0074-05

“参威骨痹方”由威灵仙、小红参、白芍等药味组成，其中威灵仙为治疗骨痹的常用药物，能祛风除湿，通络止痛;小红参（茜草科茜草属云南茜草（Rubia yunnanensis Diels）的干燥根茎[1]）为云南特色民族药具活血通经、祛风除湿、镇静镇痛、调养气血的功效[2-3];白芍、当归、川芎可辅助小红参养血活血、通络除痹，怀牛膝、桑寄生补益肝肾，强筋健骨，桂枝、独活、秦艽祛风散寒除湿，全方合用共奏滋补肝肾，祛风除湿、活血止痛之功效，在多年临床使用中对骨性关节炎有显著的疗效[4]。课题组前期已经完成参威骨痹片制备工艺研究，本文将建立参威骨痹片质量标准并对其药效学进行初步研究，为本品后期质量标准提升、治疗骨痹的机理研究和临床推广奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱系统（美国AgiLent公司）;Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm，迪马科技公司）;AB265-SMETTLER TOLEDO分析天平（瑞士梅特勒-托利多集团）;WFH-203B三用紫外分析仪（上海精科实业有限公司）;SK2200HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）;薄层层析硅胶G板（青岛海洋化工分厂、青岛鼎康硅胶有限公司）。

1.2 试药 马钱苷酸（批号：111865-201704），龙胆苦苷（批号：110770-201013），芍药苷（批号：110736-201842），桂枝对照药材（批号：121191-201605），熟地黄对照药材（批号：121196-201406），秦艽对照药材（批号：121199-201003）均购自中国食品药品检定研究院;双醋瑞因胶囊（昆明积大制药股份有限公司）;参威骨痹片（云南中医药大学第三附属医院提供，批号：2018-0603、2018-0604、2018-0605）;TNF-α检测试剂盒（南京建成生物科技有限公司）;色谱纯乙腈;其余试剂均为分析纯。

1.3 动物 SPF级大鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2018-0003）。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别 本品中当归、川芎、桂枝以细粉入药，故需对此3味药进行显微鉴别。结果显示，本品具纺锤形韧皮薄壁细胞，表面有极细微的斜向交错纹理，可见菲薄的横隔（当归）[5];具草酸钙晶体呈类圆形团块或类簇晶状，直径10～25 μm，含深黄棕色木栓细胞，表面观呈多角形，微波状弯曲（川芎）[6];具类方形或类圆形石细胞，直径30～64 μm，壁厚，有的一面菲薄，具韧皮纤维大多成束或单个散离，无色或棕色，梭状，有的边缘齿状突出，直径12～40 μm，壁甚厚，木化，孔沟不明显（桂枝）[7]。结果见图1。

2.2 TLC鉴别 取本品粉末2 g，按下述方法制备。（1）加乙醇20 mL，超声15 min，滤液蒸干，加无水乙醇1 mL使溶解;（2）加80%乙醇50 mL，超声30 min，滤液蒸干，加水10 mL使溶解，用水饱和正丁醇萃取4次，每次10 mL，水饱和正丁醇层蒸干，加甲醇2 mL溶解;（3）加甲醇20 mL，超声20 min，滤液蒸干，加甲醇1 mL使溶解，分别得桂枝、熟地黄、秦艽TLC鉴别供试品溶液，并取适量对照药材和阴性样品同法制备对照药材溶液和阴性对照溶液，分别以下述展开剂展开，石油醚（60℃～90℃）-乙酸乙酯（17：3），二甲苯-乙酸乙酯（1：1），乙酸乙酯-甲醇-水（10：2：1），前二者用二硝基苯肼乙醇试液显色，最后一种于254nm紫外灯下检视[8-10]。结果表明，各药均可被检出，且阴性无干扰。结果见图2。

2.3 强心苷限量检查[11] 本品处方含桑寄生，其中的强心苷具有心脏毒性，故需对其进行限量检查。取本品粉未45 g（本品每4.5 g含桑寄生1 g），加80%乙醇250 mL，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加热水10 mL使溶解，滤过，滤液加乙醚振摇提取4次，每次20 mL，弃去乙醚层，取水层，加醋酸错饱和溶液至沉淀完全，滤过，滤液加乙醇20 mL，加硫酸钠包和溶液脱铅，滤过，滤液加三氯甲烷振摇提取3次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加三氯甲烷l mL溶解。取溶解液点于滤纸上，干后，滴加碱性3，5-二硝基苯甲酸溶液（取二硝基苯甲酸试液与氢氧化钠试液1：1混合），未显紫红色，表明本品所含强心苷在安全剂量内。结果见图3。

2.4 多指标含量测定

2.4.1 溶液的配制 取芍药苷、龙胆苦苷、马钱苷酸适量加甲醇配制为分别含0.05、0.3、0.2 mg/mL的混合溶液。取本品2 g，精密称定，加甲醇定容至25 mL，称重，超声30 mL，用甲醇补重，滤过，取续滤液20 mL，蒸干，查残加甲醇定容至5 mL，作为供试品溶液。取不含白芍的阴性样品，按上述供试品制备方法制备，作为白芍阴性对照溶液。取不含秦艽的阴性样品，按上述供试品制备方法制备秦艽阴性对照溶液。

2.4.2 专属性试验 以C18柱为色谱柱;乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相（0～2 min时为12：88，2～3 min时由12：88梯度变化到15：85，3～6 min时为15：85，6～7 min时由15：85梯度变化到20：80，7～15 min时为20：80，15～16 min时由20：80梯度变化到60：40，V/V）;流速为1 mL/min，检测波长为236、276、230 nm;柱温为30℃;进样量为10 μL进行检测。结果显示，各指标成分色谱峰分离度良好，且无阴性干扰。结果见图3。

2.4.3 线性关系及范围 精密称取芍药苷8.15mg（含量以97.4%计），加甲醇定容至5 mL作为芍药苷对照品储备液。精密称取马钱苷酸2.21mg（含量以94.7%计），龙胆苦苷8.11mg（含量以96.9%），并精密移取芍药苷对照品储备液2 mL，加甲醇定容至10 mL，作为混合对照品溶液。取上述混合对照品溶液6 mL，加甲醇定容至10 mL，依次反复操作，得马钱苷酸浓度分别为209.29、125.57、75.34、45.21、27.12、16.27 μg/mL，龙胆苦苷浓度分别为785.86、471.52、282.91、169.75、101.85、61.11 μg/mL，芍药苷浓度分别为317.52、190.51、114.31、68.59、41.15、24.69 μg/mL，按“2.4.2”项下条件检查，计算得回归方程分别为y马=3.807x-1.815（r=0.999 67）、y龙=2.295x+6.357（r=0.999 25）、y芍=15.011+1.783（r=0.999 81）。

2.4.4 精密度试验 取“2.4.1”项下混合对照溶液，按“2.4.2”项下条件检测，连续进样6次，计算得马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷峰面积的RSD分别为0.27、0.12、0.17%，表明该仪器精密度良好。

2.4.5 稳定性试验 取“2.4.1”项下混合对照溶液及供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h，按“2.4.2”项下进行试验，计算得马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷对照品溶液的峰面积RSD分别为0.34、0.37、0.63%，供试品溶液的峰面积RSD值分别为0.27、1.04、0.63%，表明混合对照品及供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4.6 重复性试验 取同一批（2018-0603）次样品6份，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.2”项下色谱条件进行试验，计算得马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷平均含量分别为165.37、278.44、203.81 μg/g，RSD分别为1.76、1.42、1.97%，表明该方法重复性良好。

2.4.7 准确度试验 自同一批次（2018-0603）样品中取6份粉末，每份1 g，精密称定，每份加入混合对照品溶液（马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷浓度分别为125.57、471.52、190.51 μg/mL）1 mL，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.2”项下色谱条件进行试验，计算得马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷平均回收率分别为99.41、103.17、98.99%，RSD分别为2.64、2.46、2.94%，结果见表1，表明该方法准确度良好。

2.4.8 样品含量测定 取本品三批，每批两份样，按“2.4.1”和“2.4.2”项下条件检测，结果显示，马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷平均含量分别为174.04、207.73、280.45 μg/g，RSD值分别为4.02、2.50、3.37%。结果见表2。

2.5 對骨关节炎模型大鼠膝关节液TNF-α的影响

2.5.1 分组、造模及给药 将60只大鼠分为正常组、模型组、阳性药物（双醋瑞因）组、参威骨痹片低剂量组、参威骨痹片高剂量组，每组12只。除正常组外，其余各组大鼠常规消毒后用2%戊巴比妥钠注射液（0.3 mL/100 g）对大鼠进行腹腔麻醉，将大鼠仰卧捆绑于手术台上，选择右膝关节内侧剃毛，消毒，铺菌，作1个0.5～1 cm的纵行切口，充分暴露右膝关节，切除右膝关节内侧副韧带、前交叉韧带，完整切除内侧半月板，遂层缝合伤口，用无菌敷料及绷带包扎固定，术后连续5 d予以77万U/kg·d-1青霉素肌注抗炎处理，模型组和对照组混合喂养，自由活动，连续4周，4周后按体重灌胃给药（参威骨痹片低剂量组0.83 g/kg，参威骨痹片高剂量组1.66 g/kg，阳性药物组10.50 mg/kg），每日1次，连续给药4周[12-14]。

2.5.2 指标测定及数据分析 给药结束后，正常饲养1周，处死，用以注射器抽取生理盐水后，反复冲洗关节腔，收集关节液约2 mL，并放置于80℃的冰箱内保存。采用ELISA法[15]测定大鼠关节液中TNF-α，以单因素方差分析进行组间比较。结果显示，与正常组相比模型组大鼠膝关节液TNF-a水平显著升高（P<0.001）;与模型组相比参威骨痹片高、低剂量组均显著降低（P<0.01），说明参骨痹片对骨关节炎模型大鼠膝关节液TNF-a有抑制作用，提示其对骨关节炎有治疗效果。

3 讨论

本文通过显微鉴别、TLC鉴别、限量检查、多指标成分测定的方式建立了较为完整的参威骨痹片质量标准。其中含量测定指标成分芍药苷可抑制软骨细胞调亡及软骨基质破坏，从而发挥关节保护作用[16]，龙胆苦苷和马钱苷酸可通过降低全血粘度及血清中IL-1β、PGE2、NO、COX-2含量起到对大鼠骨关节炎的治疗作用[17]，以此3者为含量测定指标可更加全面、合理地对本品质量进行控制。在强心苷限量检测中，参考了15版《中国药典》中10 g桑寄生药材制备为1 mL供试品溶液后进行Kedde反应的过程，将45 g本品（含10 g桑寄生药材）制备为1 mL供试品溶液后进行检查，使检查时的上限与药典中统一。本文在TLC鉴别中仅对桂枝、熟地黄、秦艽进行了鉴别，并未达到1/3处方药味的业内要求，但在前期工作已对本品中的当归、威灵仙、川芎、白芍、独活进行了TLC鉴别研究[18]，故本品目前已建立了足够药味的TLC鉴别方法。

肿瘤坏死因子（TNF-a）在骨关节炎症病理过程中具有重要的意义，是能反应出软骨基质溶解和软骨破环的指标，其在骨关节炎软骨下骨中可通过激活破骨细胞促进骨吸收的同时，通过成骨细胞介导，抑制成骨细胞合成口型胶原，抑制骨形成和钙化，还可诱发骨母细胞产生一种破骨细胞活化因子，促进破骨细胞的骨吸收，进一步加剧对软骨下骨的破坏[19]，因此本研究以关节液中TINF-a的水平来反应骨关节炎的炎症程度具有合理性。

参考文献：

[1]陈燕芳，卞卡.茜草属药用植物茜草大叶茜草和小红参的比较研究[J].时珍国医国药，2017，28（4）：892-895.

[2]周海钧，曾育麟.中国民族药志[M].北京：人民卫生出版社，1990：82.

[3]吴征镒.新华本草纲目[M].上海：上海科技出版社，1991：456.

[4]赵蒙军.参威骨痹汤治疗膝骨关节炎肝肾亏虚证临床观察[D].云南中医学院，2015.

[5]张久旭，翟小林，王丹，等.当归粉末显微鉴别特征的ATR-FTIR光谱成像识别[J].中国现代中药，2018，20（12）：1521-1525.

[6]张小华，马新换，杨春霞，等.佛手化瘀胶囊的显微和薄层色谱鉴别研究[J].甘肃中医药大学学报，2019，36（4）：26-29.

[7]蒋秋香.救必应胃痛片质量标准的提升研究[D].广西中医药大学，2017.

[8]蔡文吉，林桂涛，邓华亮.桂红胶囊质量标准研究[J].山东中医药大学学报，2016，40（1）：77-79.

[9]叶盛英，郭琪，雷虹，等.活骨丸质量标准研究[J].药学实践杂志，2018，36（2）：156-161.

[10]王晓娜，宫志强，宋军娜，等.蠲痹颗粒质量标准研究[J].河北中医药学报，2018，33（3）：42-45.

[11]国家药典委员会编.中国药典一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015，299.

[12]伍捷进.健骨颗粒冲剂治疗膝骨关节炎的实验研究与临床观察[D].南方医科大学，2012.

[13]田亮，张伟.白三烯受体拮抗剂对过敏性鼻炎模型大鼠血清IL-6、IL-10及TNF-α表达的影响[J].河北医药，2019（19）：2889-2893.

[14]张兰春，苏义书，张子玥，等.参威骨痹片对骨关节炎模型兔膝關节液IL-1β、TNF-α的影响[J].中国中医药科技，2017，24（6）：707-709.

[15]杨鹏.跨膜型TNF-α对急性肝衰与内毒素性休克的影响[D].华中科技大学，2014.

[16]胡鹏飞.芍药苷在骨性关节炎中的作用及其机制研究[D].浙江大学，2017.

[17]张艳霞，汪洁，张启立，等.黄管秦艽中龙胆苦苷治疗骨关节炎的实验研究[J].中药材，2017，40（2）：441-445.

[18]余晓玲，袁小淋，李争艳，等.参威骨痹片的定性鉴别研究[J].云南中医中药杂志，2017，38（9）：62-64.

[19]Botha S，Watt I，Slagboom E，et al.Innate production of tumour necrosis factor α and interleukin 10 is associated with radiological progression of knee osteoarthritis[J].Ann Rheum Dis，2008，67（8）：1165-1169.

（收稿日期：2020-05-12）