规模化猪场仔猪猪链球菌分离鉴定及药物敏感性分析

曾 凯，康润敏，杨跃奎，陈晓晖，王 言，杨雪梅，康立友，于吉锋

（1.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066；2.成都市青白江区农业农村局，四川 成都 610300）

猪链球菌是一种革兰氏阳性菌，兼性厌氧性球菌。该菌感染猪后，可以引起猪脑膜炎、败血症、肺炎、心内膜炎和关节炎，给养猪业带来重大经济损失[1]。该菌主要存在于健康猪鼻黏膜和扁桃体，当猪机体免疫力下降、受到环境刺激可导致猪群发病[2]。此外，猪链球菌常可通过伤口或者胃肠道等途径感染人，从而可引起人脑膜炎及链球菌中毒性休克综合征等[3]。哺乳仔猪和刚断奶仔猪常以败血症型、脑膜炎型为主，发病率和死亡率均较高；而肥育猪发病多以关节炎或淋巴结脓肿为特征，其死亡率较低，但生长发育显著减慢。链球菌病易与猪瘟、蓝耳病等混合感染，单纯的猪链球菌病较少见，这也是近年来猪群发病后难以控制的原因之一。该病原可分为35种血清型（1～34型及1/2型），血清2型被认为致病力最强，同样也是发病猪体内时常被分离的血清型菌株，其次为血清9型[4]。近几年来，国内外出现了多例人感染猪链球菌的报告[5-7]，这表明猪链球菌对公众健康和养猪业是一个持续的威胁。

2019年10月，四川省某猪场保育猪突然发病，高热、呼吸急促、减食、腹下和四肢等处呈现弥散性出血斑点，部分病猪精神不振、畏寒等临床症状，并发生了部分保育猪死亡的情况。因此送检4头病死猪，从送检的病猪心脏中均分离出细菌；经16S rDNA测序扩增证实该菌为猪链球菌；经PCR鉴定该猪链球菌为血清2型；小鼠感染试验结果显示，该菌具有较高的致病性，进一步对该菌进行了药敏试验，为猪场对猪链球菌感染的防控提供了参考。

1 材料与方法

1.1 病料及试验动物

病料来自成都市某猪场送检的病死猪。雌性BALB/c小鼠（20只，SPF级，5周龄）购自四川大学试验动物中心。

1.2 主要试剂

细菌总DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；2×Taq PCR Mix 购自 DBI公司；DL 2 000 Plus DNA Marker，购自北京索莱宝科技有限公司；TSA（胰蛋白胨大豆琼脂）和TSB（胰蛋白胨大豆肉汤）培养基，购自北京奥博星生物技术有限公司；新生牛血清为浙江天杭生物科技股份有限公司产品；药敏纸片为杭州微生物试剂有限公司产品。

1.3 细菌分离纯化

蘸取病料内部，划线接种含5%小牛血清的TSA平板，37℃培养约18～20 h，挑取单菌落进行革兰氏染色镜检；挑取经鉴定的疑似猪链球菌单菌落，接种于添加5%新生牛血清的TSB培养基，37℃培养18～20 h，用于后续试验。

1.4 细菌种类及血清型鉴定

参考文献报道的16S rDNA序列设计合成引物16S rDNA引物（表1），以纯化细菌的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后送交北京擎科新业生物技术有限公司测序。同时，参考文献设计猪链球菌血清1型、2型、7型和9型的特异性引物（表1），以纯化细菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增，进一步确定猪链球菌血清型。

表1 引物列表

1.5 致病性试验

取培养的猪链球菌菌液，5 000 r/min离心去上清液，采用PBS重悬菌体，并调整重悬菌液浓度到1×109CFU/mL。将BALB/c小鼠随机分为2组（Ⅰ、Ⅱ），每组10只。Ⅰ组小鼠腹腔注射0.2 mL猪链球菌菌悬液；Ⅱ组小鼠腹腔注射20 μL PBS，作为对照组。注射后观察7 d，每天记录存活情况。

1.6 药敏试验

挑取平板上的单菌落，接种于添加5%新生牛血清的TSB培养基，37℃摇菌过夜。用PBS稀释菌液到0.5麦氏浊度标准，取200 μL将其均匀涂布于添加5%新生牛血清的TSA平板上。选取21种常用药物的药敏纸片，贴于涂布细菌的平板上，每块平板上贴6个药敏纸片，37℃过夜培养，取出并测量抑菌圈直径。参考药敏纸片说明书判定药敏结果。

2 结果与分析

2.1 细菌镜检

TSA平板（含5%新生牛血清）菌落为圆形、光滑、半透明的小菌落，革兰氏染色为阳性成对或者短链状（图1）。

2.2 细菌的血清型

采用PCR扩增16 S引物扩增细菌16 S基因片段（图2），经北京擎科新业生物技术有限公司测序，序列经NCBI比对确定为猪链球菌；采用血清型鉴定引物对鉴定的猪链球菌进行分型鉴定，2型引物扩增出大小为450 bp片段，而用其他分型引物未扩增出DNA片段（图3），因此确定分离菌株为猪链球菌2型。

2.3 致病性试验

用BALB/c小鼠评估了分离菌株的致病性。在注射菌体混悬液后24 h，Ⅰ组有9只小鼠死亡，7 d内存活1只。对照组无小鼠死亡，说明猪场分离的2型猪链球菌具有很高的致病性。

2.4 药物敏感性试验

分离株的药物敏感性如表2所示，分离株对10种药物敏感，对11种药物表现出耐药或中介。分离株主要对喹诺酮类（恩诺沙星）和β-内酰胺类（阿莫西林、氨苄西林、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢拉定、头孢克洛）的药物表现出较强的敏感性，而对氨基糖苷类（卡那霉素、庆大霉素、链霉素、阿米卡星）、大环内酯类（红霉素、阿奇霉素）、四环素类（四环素、强力霉素）、氯霉素类（氟苯尼考）、林可胺类（林可霉素）、磺胺类（磺胺间甲氧嘧啶钠）均产生了较强的耐药性。

表2 药物敏感性试验

3 讨论与结论

猪链球菌是猪群自然携带的病原菌之一，近年来，随着中国集约化养猪的发展，猪链球菌病呈现出高发的态势。该研究从四川省某猪场的送检病死猪中分离出3株细菌，经16S rDNA测序确定为猪链球菌，同时采用分型鉴定PCR方法针对分离毒株进行了血清型的鉴定，同时，小鼠的致病性结果表明，该分离毒株具有较强的致病性，据此可推断该猪场的病原为猪链球菌2型。

为了给该场的疫病防控及治疗提供参考数据，该研究对分离菌株进行了药物敏感性方面的研究，结果表明，分离株主要对β-内酰胺类药物表现出较强的敏感性，而对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类、林可胺类、磺胺类均产生了较强的耐药性。因此该场的猪链球菌治疗优先选择喹诺酮类（恩诺沙星）和β-内酰胺类（青霉素类和头孢类）药物。