菌酶协同发酵对大豆皮抗营养因子降解效果的影响

韩 丽，彭 翔，严 峰，李 阳，王海燕，蔡辉益，2，张广民

（1.北京挑战生物技术有限公司，北京 海淀 100081；2.中国农业科学院饲料研究所，北京 海淀 100081）

近年来，关于膳食纤维的研究与应用已成为国内外研究的热点。有研究表明，膳食纤维组成对动物不同生长阶段的营养作用表现不同，可解决仔猪腹泻、母猪便秘等问题。但目前我国对富含膳食纤维的非常规饲料资源利用并不充分，其中就包括大豆皮。大豆皮主要由半纤维素和纤维素等组成，具有膳食纤维含量高，水分、霉菌毒素、木质素含量低，可消化程度高，产量大等优势，其不溶性碳水化合物具有调节肠道菌群平衡、改善肠道健康等作用[1-2]。可见，大豆皮作为一种膳食纤维原料在动物生产中有很好的饲用价值。有报道称，大豆皮对生长猪生长性能和养分表观消化率无不良影响，并可减少其粪便中氨气的排放量[3]，还可降低饲料成本，开拓饲料资源；大豆皮可提高仔猪窝均初生重、窝均断奶重、断奶存活率，改善母猪繁殖性能[4]。但由于大豆皮含有较多的抗营养因子，导致其在畜禽生产上的应用受到一定限制[5]。因此，基于大豆皮的产量优势和使用优势，研究与开发利用豆皮资源新途径，消除其抗营养因子及致敏性，提高其饲用价值具有重要意义。

目前，常用的消除大豆中抗原蛋白的处理方法主要有微生物发酵和蛋白酶酶解技术，前者是通过发酵使菌产生蛋白酶发挥作用；后者是利用蛋白酶制剂将抗原蛋白降解，消除其致敏性；但两者均存在一定的弊端，如适口性差、质量不稳定或不易保存等问题[6-7]。而菌酶协同发酵技术可弥补上述处理方法的不足，已成为现在发酵饲料的主流模式。笔者前期通过对酸性、中性和碱性蛋白酶进行体外酶解试验发现，碱性蛋白酶酶解豆皮可显著提高抗原蛋白降解率，消除抗原蛋白的致敏性。而植物乳杆菌在微生物体外发酵过程中可产生乳酸等多种活性物质，且可降低肠道pH，抑制肠道内有害菌生长，使发酵料储存时间延长；而酿酒酵母菌可产生酒精等，使发酵料气味香醇，改善发酵料气味。但目前关于菌酶协同发酵技术在大豆皮上的研究报道却相对较少。因此，本研究采用菌酶协同发酵技术，通过体外酶解发酵试验，评估不同碱性蛋白酶、不同发酵剂组合、不同发酵参数（加酶量、酶解时间、含水量等）对大豆皮抗原蛋白降解效果的影响，以提高大豆皮的营养价值和饲用价值，旨在为开发功能性膳食纤维发酵饲料提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2019年8—12月在挑战集团研究院进行。

1.2 试验材料

试验用豆皮由秦皇岛金海粮油工业有限公司提供；试验用酶制剂和试验用菌均由北京挑战生物技术有限公司提供。试验用酶制剂主要有碱性蛋白酶1号、碱性蛋白酶2号、碱性蛋白酶3号和碱性蛋白酶4号，其酶活力分别为20万 U/g、5万 U/g、5万U/g、20万U/g；试验用菌主要有枯草芽孢杆菌、植物乳酸菌、酿酒酵母菌，其接菌量分别为1×108CFU/g、1×107CFU/g 和 1×105CFU/g；试验用培养基包括MRS培养基、胰蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、氯化钠、糖蜜和尿素等。

1.3 试验仪器

Bio-rad全自动酶标仪；超速离心机；FOSS2300型全自动凯氏定氮仪；pH计；恒温振荡器；恒温培养箱；粉碎机；过滤筛；精密电子天平（精确到0.000 1 g）；封口机；烘箱等。

1.4 试验方法

1.4.1 发酵大豆皮相关指标测定 按照酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒说明进行大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量的快速定量检测及计算，该试剂盒由北京龙科方舟生物工程技术有限公司提供；按照GB/T 6435—2014的方法进行干物质测定；用pH计测定发酵豆皮pH；采用生物传感分析仪进行乳酸测定。

1.4.2 菌株活化 将实验室保存的3种菌种按1%体积分别接种于MRS培养基、PDA培养基或LB培养基中，30℃或37℃活化21 h后，按同样的方式进行二次扩培，获得枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母菌的菌液，备用。

1.4.3 菌酶协同发酵豆皮的制备 在菌酶协同发酵豆皮试验中，将碱性蛋白酶、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌或酿酒酵母菌菌液以及糖蜜和尿素按一定比例加入到一定量的蒸馏水中混匀，并全部转移至装有大豆皮的发酵呼吸袋内，混匀后封口机封口进行发酵。其中，以加酶量200 U/g、酶解时间72 h、含水量45%、发酵温度30℃为试验开始时的基础参数，每个组均设3个重复，发酵结束后按照GB/T 14699.1—2005进行采样，55℃烘干并粉碎，过60目筛，通过上述测定方法测定发酵前后豆皮中抗营养因子、乳酸或pH等指标，并对各指标进行计算，进而筛选较优碱性蛋白酶种类、发酵剂组合和菌酶协同发酵参数。后期试验根据前期试验所得结果进行相关单因素调整。

1.4.4 发酵用蛋白酶的筛选 大豆皮、糖蜜、尿素、植物乳杆菌和酿酒酵母菌菌液按 100∶2∶0.5∶1∶0.01 比例添加并补充200 U/g的不同种蛋白酶（碱性蛋白酶1号、碱性蛋白酶2号、碱性蛋白酶3号和碱性蛋白酶4号）进行发酵，其他发酵条件同1.4.3。

1.4.5 不同发酵剂组合的筛选 将大豆皮、糖蜜、尿素、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌或酿酒酵母菌菌液其中的两种或多种按 100∶2∶0.5∶1∶1∶0.01 比例添加，制成4种不同发酵剂组合，其中发酵剂组合1包括大豆皮、糖蜜、尿素、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌或酿酒酵母菌；发酵剂组合2包括大豆皮、糖蜜、尿素、植物乳杆菌和酿酒酵母菌；发酵剂组合3包括大豆皮、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母菌；发酵剂组合4包括大豆皮、植物乳杆菌和酿酒酵母菌。每个发酵剂组合分别添加50 U/g和100 U/g两个添加量的蛋白酶（根据1.4.4试验结果确定蛋白酶种类）进行发酵。其他发酵条件同1.4.3。

1.4.6 菌酶协同发酵工艺优化 单因素试验涉及菌酶协同发酵豆皮所用碱性蛋白酶加酶量（50 U/g、100 U/g和 200 U/g），酶解时间（24 h、48 h 和 72 h），含水量（40%、45%或50%）的筛选。根据上述筛选结果进行发酵参数优化试验，其他发酵条件同1.4.3。

1.5 试验方法

试验数据用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD法多重比较，数据均以平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶发酵大豆皮对其抗原蛋白降解效果的影响

由表1可知，4种蛋白酶酶解大豆皮72 h时，与其他3种酶相比，蛋白酶3号对大豆皮中球蛋白降解效果显著提高（P<0.05）；而与蛋白酶2号相比，蛋白酶3号对大豆皮中β-伴大豆球蛋白降解效果显著提高（P<0.05），但与其他2种酶无显著差异。这说明大豆皮中添加蛋白酶3号酶解大豆皮抗原蛋白效果较佳，后期试验选择蛋白酶3号进行菌酶协同发酵工艺优化。

表1 不同蛋白酶酶解大豆皮对其抗原蛋白降解效果的影响

2.2 不同发酵剂组合发酵大豆皮对其抗原蛋白降解效果的影响

由表2可知，当在不同发酵剂组合中添加50 U/g或100 U/g蛋白酶3号，发酵剂组合2对大豆皮中球蛋白和β-伴球蛋白降解效果相对较佳，乳酸含量较高，pH相对较低。当在不同发酵剂组合中添加50 U/g蛋白酶3号，其中发酵剂组合2中球蛋白和乳酸含量显著高于发酵剂组合1、3或4（P<0.05）；当在不同发酵剂组合中添加100 U/g蛋白酶3号，其中发酵剂组合2中β-伴球蛋白降解率和乳酸含量显著高于发酵剂组合1、3或4（P<0.05）。这说明大豆皮中补充组合为糖蜜、尿素、植物乳杆菌和酿酒酵母的发酵剂并添加蛋白酶3号进行菌酶协同发酵可达到很好的发酵效果。因此，后期试验选用发酵剂组合2进行菌酶协同发酵工艺优化。

表2 不同发酵剂组合发酵大豆皮对其抗原蛋白降解效果的影响

2.3 菌酶协同发酵工艺优化

2.3.1 加酶量对大豆皮抗原蛋白降解效果的影响由表3可知，在补充发酵剂组合2的大豆皮体系中添加100 U/g和200 U/g蛋白酶3号，并发酵48 h时，其对球蛋白和β-伴大豆球蛋白降解效果显著优于其50 U/g加酶量（P<0.05）；其中，当蛋白酶3号加酶量为100 U/g和200 U/g时，其球蛋白和β-伴大豆球蛋白降解率分别为81.98%和78.72%、85.18%和80.79%，且两者降解效果差异不显著（P＞0.05）。因此，考虑成本问题，后期试验将选用加酶量为100 U/g碱性蛋白酶进行菌酶协同发酵工艺优化。

表3 蛋白酶不同加酶量发酵大豆皮对其抗原蛋白降解效果的影响

2.3.2 发酵时间对大豆皮抗原蛋白降解效果的影响由表4可知，通过测定不同发酵时间点大豆皮抗原蛋白含量发现，发酵48 h和72 h时大豆皮抗原蛋白降解率显著高于发酵24 h（P<0.05）；其发酵48 h和72 h时大豆皮球蛋白降解率分别为85.18%和87.06%，β-伴大豆球蛋白降解率分别为80.63%和82.56%，且发酵48 h与发酵72 h时大豆皮抗原蛋白降解率变化不大，因此选发酵大豆皮48 h进行后期试验。

表4 酶解时间对大豆皮抗原蛋白降解效果的影响

2.3.3 含水量对大豆皮抗原蛋白降解效果的影响由表5可知，通过测定发酵大豆皮48 h其抗原蛋白含量发现，发酵体系含水量为45%时大豆皮抗原蛋白降解率显著高于发酵体系含水量为40%和50%。可见，蛋白酶3号发酵大豆皮含水量为45%时，其发酵效果较优。

表5 含水量对大豆皮抗原蛋白降解效果的影响

3 讨论

大豆皮中含有相当高水平的抗营养因子，尤其是球蛋白和β-伴球蛋白，其含量分别约为28 mg/g和52 mg/g。有报道称，大豆中抗原蛋白具有很强的免疫原性，其可通过畜禽小肠上皮细胞的空隙进入血液和淋巴，使机体出现迟发型过敏反应[5]，促使肥大细胞释放组胺等有害物质，引起肠道通透性增加以及肠道绒毛萎缩等，最终造成肠道损伤，影响营养物质的消化吸收，不利于畜禽生长[5]。而菌酶协同的发酵技术可消除大豆皮中的多种抗营养因子，但其发酵效果受酶制剂种类和发酵体系pH等因素的影响。本试验通过采用菌酶协同技术，对几种碱性蛋白酶在大豆皮抗原蛋白降解效果进行评估，发现不同种碱性蛋白酶对抗原蛋白作用效果不同，碱性蛋白酶3号相比其他酶对大豆皮抗原蛋白的降解效果较佳。其原因可能是因为蛋白酶不总是降低其生物学致敏性，其对抗原蛋白的降解具有蛋白酶特异性，使其作用于大豆球蛋白和β-伴球蛋白各亚基或结构[8]，从而使其得以降解；也可能是因为蛋白酶在大豆皮发酵体系中的此pH条件下具有高酶活。有报道称，碱性蛋白酶在碱性条件下对抗原蛋白具有较好的降解能力[7]。又由于大豆皮营养成分比较单一，不利于微生物发酵。因此，本试验接着通过在已添加一定量蛋白酶3号的大豆皮中补充不同发酵剂组合以调节发酵料pH并补充养分，发现发酵剂组合为糖蜜、尿素、植物乳杆菌和酿酒酵母时，其发酵效果较好，有效降低了大豆皮抗原蛋白含量，促进了乳酸产生，并降低了发酵大豆皮pH，提高了大豆皮发酵深度，改善发酵料气味及其品质和稳定性。可见，菌酶协同发酵能够有效地提高饲料品质。这可能是因为在大豆皮中接入乳酸菌和酵母菌等有益菌进行发酵[9]，可产生多种有益活性成分和香味物质，达到改善发酵料产品品质的目的[10]。这与张煜等[11]研究结果基本一致。蔡国林等[12]也表明，利用蛋白酶和植物乳杆菌发酵花生粕，可显著降解大分子蛋白，提高必需氨基酸含量，改善了其品质。

菌酶协同的发酵效果受酶制剂加酶量、酶解发酵时间和含水量等多种因素的影响。因此，本试验对菌酶协同发酵大豆皮的工艺条件进行优化。本试验发现，不同剂量的蛋白酶3号对大豆皮中球蛋白和β-伴大豆球蛋白有不同程度的酶解效果，表现为随着加酶量的增加其抗原蛋白降解率随之增加。这可能是因为底物量一定，随着酶添加量的不断增加，酶与底物的结合效率也不断增加，从而引起抗原蛋白降解率的增加[13]。本试验还发现添加100 U/g和200 U/g的蛋白酶3号对球蛋白和β-伴球蛋白降解效果差异不大，前者球蛋白和β-伴球蛋白降解率分别为81.98%和78.72%，后者球蛋白和β-伴球蛋白降解率分别为85.18%和80.79%。这可能是因为当酶添加量过量时，酶分子趋于饱和，可能出现酶分子自身水解现象，造成酶对底物的作用减弱，对抗原蛋白的去除贡献不大，这与前人的研究基本一致[13]。另外发现，蛋白酶3号对大豆皮球蛋白的酶解效果相对较好。这可能是因为蛋白酶3号能破坏其中的二硫键，作用于球蛋白各亚基更好地发挥降解作用。可见，菌酶协同的发酵技术确实是去除抗原蛋白的有效方法，考虑成本问题，选择蛋白酶3号加酶量100 U/g为宜。

蛋白酶酶解效果受酶解时间的影响，为了使蛋白酶3号能在适宜的时间范围内发挥最大的酶解效率，我们对酶解时间进行了研究。本试验发现不同酶解时间对抗原蛋白的降解程度不同，且随着蛋白酶3号酶解时间的延长其抗原蛋白降解率随之增加，但酶解超过48 h以后，延长酶解时间对蛋白酶的酶解效率影响较小。这可能是因为是随着酶解时间的延长，酶解底物浓度降低，酶反应速度逐渐下降，再加上酶解体系pH降到低于酶最适pH，酶解反应将会受到抑制[14]。大豆皮抗原蛋白的降解效果同时受含水量的影响。本试验通过对发酵体系含水量进行研究发现，大豆皮中抗原蛋白的降解受含水量的影响显著，且发酵体系含水量45%时其对抗原蛋白的降解效率较优；并发现酶解效率随含水量的增加呈现先上升后下降的趋势。这可能是因为发酵体系含水量从50%降到45%过程中，有利于酶与底物结合，但当含水量从45%降到40%时，酶解体系渗透液相应减少，导致酶解反应速率减缓[14]。有报道称，微生物发酵大豆皮可提高粗蛋白质含量、降低粗纤维含量和脲酶活性，进而提高大豆皮的营养价值[15]。可见，本研究利用菌酶协同的发酵技术，通过对发酵参数和发酵体系pH等进行优化，可将大豆皮中的球蛋白和β-伴球蛋白等抗营养因子有效去除，并可增加其适口性，提高大豆皮产品品质及储存稳定性，以改善动物肠道健康，提高其饲用价值。

4 结论

在本试验条件下，采用菌酶协同厌氧发酵模式，综合考虑了抗原蛋白降解情况、发酵深度、产酸情况、发酵料气味，以及发酵工艺成本等，最终确定的发酵剂组合为糖蜜、尿素、植物乳杆菌和酿酒酵母菌；工艺条件为：植物乳杆菌1%，酿酒酵母菌0.01%，加酶量为100 U/g，发酵时间为48 h，含水量45%，发酵温度为30℃时，其对大豆皮发酵效果较优，可有效消除其抗营养因子，改善发酵料品质、适口性、减少染霉风险，且产品质量稳定，可拓宽大豆皮在动物饲粮中的应用，以实现大规模生产。