细菌型豆豉中呕吐型蜡样芽孢杆菌的产毒研究

贡献，佟硕秋，吴拥军

(贵州大学 生命科学学院，山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室，山地生态与农业生物工程协同创新中心，贵阳 550025)

豆豉是我国一种传统的大豆发酵产品，具有悠久的历史。因其独特的风味和口感、极高的食用价值、一定的药理作用[1]，深受广大消费者的喜爱。同时，近年来随之出现的豆豉中毒事件也备受广大群众的关注。研究者对豆豉发酵过程中菌群的动态变化进行了研究，发现豆豉在发酵过程中受到不同杂菌的污染[2]。目前在豆豉中毒事件中，报道的病原菌主要有肉毒杆菌[3]、大肠杆菌[4]、蜡样芽孢杆菌[5]，而豆豉中毒事件中70%都是由于蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus，BC)污染豆豉以及其产毒所导致的。

蜡样芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，是一种主要由禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌与粉红镰刀菌产生的B型单端孢酶烯族化合物[6]，其生长温度范围较广(10～45 ℃)，是一种好氧产孢菌，可生长于pH值2～11的条件下，在无盐环境下生长良好，当氯化钠浓度为1%时生长最佳，8%时有抑制作用[7]。蜡样芽孢杆菌广泛存在于食物中，易引起食物中毒[8]。由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒，有呕吐型和腹泻型两种。腹泻型蜡样芽孢杆菌主要由腹泻型肠毒素引起，多见于美国，该毒素不耐热，一般通过加热即可使其失活，腹泻型中毒主要与蜡样芽孢杆菌的活菌数有关[9]。而呕吐型蜡样芽孢杆菌中毒主要由呕吐毒素基因ces翻译的耐热性肠毒素呕吐素(cereulide)引起，呕吐型蜡样芽孢杆菌中毒仅与产呕吐毒素菌株的活菌数有关。在我国呕吐型蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒十分常见[10]，感染该毒素的患者伴有腹痛、腹泻、恶心呕吐、无发热[11,12]。蜡样芽孢杆菌在室温20 ℃左右能很好繁殖, 且具有形成耐热芽孢的特性,通常食品加热烹调(热冲击) 无法使该菌的芽孢失活, 芽孢则会残存发芽[13]，并释放毒素。研究发现cereulide的剂量在5～10 ng/g会引起食物中毒[14,15]，对食品的安全性造成严重隐患。

研究通过对蜡样芽孢杆菌计数结果为阳性的豆豉样本提取其宏基因组，利用呕吐毒素ces基因特异性引物，对蜡样芽孢杆菌阳性豆豉样本中呕吐毒素基因ces进行PCR扩增，检测样本中呕吐型蜡样芽孢杆菌，检出率为92.6%，结果揭示了蜡样芽孢杆菌阳性豆豉样本中呕吐型BC的存在情况。而后，采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)对自然发酵和纯种强化发酵豆豉成品中所含的呕吐毒素cereulide进行定量检测[16]，发现自然发酵和纯种发酵豆豉中呕吐毒素cereulide含量分别为(0.0106±0.0006) μg/kg和(0.029±0.0002) μg/kg，远低于我国国标GB 2761-2017中规定的发酵豆制品中次生有毒代谢产物的限定含量5 μg/kg[17]。通过对呕吐型蜡样芽孢杆菌产生的cereulide进行定量分析，对豆豉的食用安全性进行评价，表明该细菌型豆豉短时间内暂不存在cereulide超标引发的安全性问题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株：蜡样芽孢杆菌，为实验室保藏菌株。

取贵阳某食品厂的自然发酵不同发酵时期蜡样芽孢杆菌阳性豆豉样本18个(ZR6h、ZR12h、ZR18h、ZR24h、ZR30h、ZR36h、ZR42h、ZR54h、ZR60h、ZR66h、ZR72h、ZR1d、ZR2d、ZR3d、ZR4d、ZR5d、ZR6d、ZR7d)，纯种发酵不同发酵时期蜡样芽孢杆菌阳性豆豉样本9个(CZ0h、CZ6h、CZ1d、CZ2d、CZ3d、CZ4d、CZ5d、CZ6d、CZ7d)，共27个阳性豆豉样本(实验中使用的蜡样芽孢杆菌阳性豆豉样本中，蜡样芽孢杆菌含量均未超过105CFU/g)。

Takara Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒;Takara 2×Taq Master Mix; 引物由上海生工生物工程公司进行合成;cereulide标准品(HPLC 级)：购于德国Merck公司;本研究所用全部化学试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KBS全自动高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂；SW-CJ-IFD标准型净化工作台 上海锦星科学仪器有限公司；TGL-161高速台式离心机 美国Sigma公司；XO超声波细胞破碎仪 南京先欧仪器制造有限公司；My-Cycler PCR、Gel Doc XR凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；Masslynx工作站 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 豆豉中呕吐型蜡样芽孢杆菌呕吐毒素ces基因检测

1.3.1.1 蜡样芽孢杆菌DNA提取

采用普通热裂解法提取DNA[18]。

1.3.1.2 豆豉样本宏基因组DNA提取

豆豉样本宏基因组DNA提取采用Takara Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取基因组。样品预处理过程如下：

从实验室前期筛选的27个蜡样芽孢杆菌阳性豆豉样本中，各取5 g豆豉置于10 mL无菌PBS(pH 7.2)缓冲液中，150 r/min，离心30 min后沉降5 min；吸取1 mL菌悬液，12000 r/min，离心2 min，弃上清；加1 mL无菌水重悬清洗，12000 r/min，离心2 min，收集菌体。

1.3.1.3 PCR扩增

Primer 5.0软件设计特异性引物PcesF/PcesR(PcesF):5′-ACCCATCTTGCGTCATT-3′(PcesR)：5′-CAGCCAAGTGAAGATACC-3′，对豆豉样本中呕吐毒素基因ces进行PCR扩增检测。反应体系：2×Taq Master Mix 5.0 μL、Up-primer(PcesF, 10 μmol/L)0.5 μL、Down-primer(PcesR,10 μmol/L)0.5 μL、Template DNA 3.0 μL，ddH2O 1.0 μL。反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃终延伸6 min。PCR产物于2%琼脂糖凝胶，100 V恒压电泳30 min。

1.3.2 豆豉中呕吐毒素cereulide含量的测定

1.3.2.1 样品前处理

称取自然发酵豆豉样本、纯种强化发酵豆豉样本各1 g于15 mL离心管中。加入2 g无水Na2SO4和10 mL甲醇混匀，静置30 min。70%功率超声破碎10 min(超声0.2 s，停1.0 s，振幅22%)后，3000 r/min离心10 min。吸上清液于新离心管中。剩下的沉淀继续加入10 mL甲醇，重复超声提取步骤。再吸取上清液并与之前提取的上清液合并。吸取20 mL提取液于真空浓缩机中冻干，用甲醇∶水溶液(80∶20，V/V)定容至400 μL。上述液体过0.2 μm滤膜后定容至400 μL，10000 r/min离心15 min，转移上清至1 mL离心管中待测。

1.3.2.2 绘制标准曲线

取标准品贮备液用80%甲醇稀释，准确配制(梯度稀释)成浓度分别为0.010,0.10,0.50,1.0,5.0,30 μg/L的cereulide标准系列溶液。

1.3.2.3 色谱条件与质谱条件

参照参考文献[19,20]。

1.3.2.4 回收率

向已知cereulide浓度样品中添加4种不同浓度的标准溶液后，放置30 min使待测组分与样品基体成分相互作用达到平衡，再将样品前处理得到的样品溶液在上述色谱和质谱条件中进行检测。

2 结果与分析

2.1 豆豉样本中ces基因检测

由图1可知，27个豆豉样本(纯种发酵9个、自然发酵豆豉样本18个)中，纯种发酵有8个豆豉样本为阳性，检出率为88.9%；自然发酵中，有18个豆豉样本为阳性，检出率为100%。呕吐型BC的平均检出率为96.3%。在CZ0h中未检测出呕吐型BC，原因可能是此时的豆豉样本前发酵早期，呕吐型BC菌数处于较少阶段，导致提取的宏基因组浓度低于PCR检测的最低检测浓度，故无法进行检测。

图1 豆豉样本中呕吐毒素基因 ces 检测Fig.1 Detection of cereulide gene ces in the fermented soya beans samples注：M为DL2000 Marker；泳道1为阴性对照；泳道2为阳性对照；泳道3～11为CZ0h、CZ6h、CZ1d、CZ2d、CZ3d、CZ4d、CZ5d、CZ6d、CZ7d；泳道12～29为ZR6h、ZR12h、ZR18h、ZR24h、ZR30h、ZR36h、ZR42h、ZR54h、ZR60h、ZR66h、ZR72h、ZR1d、ZR2d、ZR3d、ZR4d、ZR5d、ZR6d、ZR7d。

2.2 呕吐毒素cereulide标准曲线绘制

采用UPLC-MS/MS分别检测样品空白(80%甲醇)、标准样品(0.010，0.10，0.50，1.0，5.0，30 μg/L)，根据质谱定量信号计算相应浓度，结果见表1。

表1 标准曲线原始数据Table 1 The original data of standard curve

由图2可知cereulide出峰时间约在3.3 min。

图2 cereulide标准品LC-MS色谱图Fig.2 The LC-MS chromatogram for cereulide standard sample

构建呕吐毒素标准曲线方程，见图3。标准曲线方程为Y=1.59e4+4.4Xe6，X表示呕吐毒素cereulide浓度，Y表示响应值，相关系数(R2)>0.99，可见呕吐毒素cereulide在0.10～30 μg/L范围内呈良好的线性关系。

图3 呕吐毒素cereulide标准曲线Fig.3 The standard curve of emetic toxin cereulide

2.3 豆豉中呕吐毒素cereulide含量检测

根据1.3.2所述进行呕吐毒素含量测定，首先对自然发酵成品豆豉和纯种发酵成品豆豉中的cereulide进行提取，然后对其进行UPLC-MS定量检测，结果见图4和图5。

图4 纯种强化发酵豆豉MRM色谱图Fig.4 MRM chromatogram of pure fermented soya beans

图5 自然发酵豆豉 MRM 谱图Fig.5 MRM chromatogram of natural fermented soya beans

根据两个样本的质谱峰面积计算相应样本浓度。样本中蜡样芽孢杆菌呕吐毒素cereulide定量数据见表2。

表2 呕吐毒素 cereulide 检测Table 2 Detection of emetic toxin cereulide

由表2可知，自然发酵豆豉中呕吐毒素cereulide含量约为(0.0106±0.0006) μg/kg，纯种发酵豆豉中呕吐毒素cereulide含量约为(0.0289±0.0002) μg/kg。纯种强化发酵豆豉中呕吐毒素cereulide含量高于自然发酵豆豉。但两种方式发酵豆豉的呕吐毒素cereulide都远低于国标GB 2761-2017发酵豆制品中次生有毒代谢产物的限量安全标准5.0 μg/kg。从呕吐毒素的含量上来看，目前该豆豉暂时不存在蜡样芽孢杆菌产生的呕吐毒素引发的食用安全性问题。

豆豉作为中国传统的风味食品，其安全性受到人们的广泛关注，对豆豉的安全性进行评价时，除了研究蜡样芽孢杆菌数量外，还需对其产生的呕吐毒素含量进行评价。目前，控制豆豉发酵过程中呕吐型蜡样芽孢杆菌的污染是一个急需解决的问题，因豆豉的后发酵是一个相对封闭的过程，难以实现在后发酵过程中控制呕吐型蜡样芽孢杆菌污染，所以前发酵和配料灌装是控制呕吐型蜡样芽孢杆菌的污染源头的关键之一。

2.4 呕吐毒素cereulide加标回收率检测

在豆豉样品中添加不同浓度的呕吐毒素标准溶液(见表3)，测定其加标回收率。

表3 加标回收率Table 3 The recovery rate of cereulide

由表3可知，加标回收率在81.9%～87.4%之间，可见该方法的回收率较好，准确性较高，能满足检测要求。

3 结论

本研究对豆豉样品中呕吐毒素ces基因进行PCR扩增，27个豆豉样本中，26个豆豉样本检测为阳性，检出率高达96.3%，该地区食品厂豆豉易出现呕吐型蜡样芽孢杆菌污染的情况。对样本中呕吐毒素进行定量检测，自然发酵豆豉中含量达(0.0106±0.0006) μg/kg，纯种发酵豆豉中含量达(0.0289±0.0002) μg/kg，均未超过国家标准，并且呕吐毒素标准品在设定质量浓度范围内线性良好(R2>0.99)，加标回收率在81.9%～ 87.4%之间，实验重复性和仪器精密度较好。综上所述，通过对该地区豆豉样本进行呕吐毒素定量分析，发现目前该地区食品厂生成的豆豉暂时不存在蜡样芽孢杆菌产生的呕吐毒素引发的食用安全性问题。本研究通过对不同发酵方式豆豉中呕吐型蜡样芽孢杆菌进行检测，再对其中呕吐毒素含量进行定量分析，对豆豉生产企业进行食品安全控制具有重要指导意义。