母乳中细菌种类及其检测方法

王雯丹，董彩霞，刘 彪，荫士安

(1.内蒙古伊利实业集团股份有限公司，伊利母婴营养研究院，北京 100022；2.甘肃省疾病预防控制中心，甘肃 兰州 730000；3.中国疾病预防控制中心营养与健康所，北京 100050)

近年来越来越多的研究报道，不管是全母乳还是混合喂养，对于婴儿肠道菌群的组成与定植以及肠道免疫功能的启动与成熟均非常重要；且母乳喂养与婴儿粪便中高丰度双歧杆菌的数量显著相关；停止(或过早停止)母乳喂养将导致以厚壁菌门为标志的婴儿肠道微生态的快速成熟[1]。母乳喂养是与婴儿肠道菌群早期形成关联最密切的因素。本文综述了母乳中存在的细菌种类及检测方法等。

1 母乳中的细菌种类及数量

由于传统观点认为人乳清洁无菌，使得人乳中细菌成分以及在婴儿肠道成熟与免疫功能建立方面的重要作用长期被忽视。近二十年的研究结果表明，母乳喂养持续不断地为婴儿肠道提供共生菌、互生菌和/或益生菌。这些发现也让人乳微生物组学的研究成为近年来关注和研究的热门领域。

2013年，Martin等学者在健康母亲的乳汁中通过灭菌采样方法，首次发现人乳中存在乳酸菌(非外源性污染)，确认人乳中存在非致病菌；随后已发现人乳中超过200多种不同的微生物(属于50种不同菌属)[2]，个体间差异相当大[3-5]，且受检测技术的影响。影响母乳菌群组成的因素主要有：母亲自身因素，包括体重、过敏史、膳食、免疫状态等；产后因素，包括分娩方式、孕龄、母亲抗生素类药物使用、哺乳期等[6-7]；此外，喂养方式、人乳寡糖的含量、地域环境等都可能影响母乳的菌群结构[8-10]。

人乳是婴儿肠道细菌的主要来源。按婴儿每天摄入约800mL母乳计算，母乳喂养儿摄入约十万到一千万的细菌。这也能解释为何母乳喂养婴儿的肠道菌群与其母亲乳汁中发现的菌群组成密切相关[11]。母乳也是母乳喂养儿共生菌和益生菌的来源，包括葡萄球菌、乳酸菌和双歧杆菌、链球菌、棒状杆菌等[12]，其中乳酸菌和双歧杆菌被认为是益生菌[13]。人乳基因组分析结果显示，人乳微生物群主要由葡萄球菌、假单胞菌和爱德华氏菌占主导，也含少量其他菌种[14-15]。

Sakwinska等[16]汇总了人乳微生物检测结果，有相似结论，即人乳中微生物群主要由共生的葡萄球菌(如表皮葡萄球菌和链球菌)组成。Togo等[17]梳理了人乳微生物文献，包括38个国家/地区的242篇论文，涉及10 000多名母亲的15 000多份乳房与母乳微生物采样样本。共发现820个微生物物种，主要是变形菌门和厚壁菌门，出现频次降序排列为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌等。

2 母乳中细菌种类的文献综述

Latuga等[6]汇总了用培养基和生物学方法发现的母乳中常见细菌(表1)；Fernandez等[11]梳理了文献报道的采用传统细菌分离或DNA检测手段的研究(表2)；基于不同国家/地区的人乳中检测到的细菌种类总结于表3。

表1 用培养基和生物学方法发现的母乳中常见细菌种类

表2 用传统细菌分离或DNA检测发现的母乳中常见细菌种类

续表2

表3 不同国家报告的母乳中常见的细菌种类

3 母乳中细菌的检测方法

目前对母乳菌群的研究仍处于初期，早期检测方法是用传统培养基将获取的母乳样品进行培养和分离。由于绝大多数现场采集的人体样品中，微生物无法直接进行体外人工培养，因此在DNA测序技术，特别是宏基因组技术成熟之前，人们无法确定人乳中微生物的菌落组成，更谈不上研究菌落的多样性和稳定性。归功于近十年来新一代测序技术的发展，人们对体内微生物群落组成的理解有了显著进展。目前用于鉴别人乳微生物的常用方法有培养基筛查法和不依赖培养基的方法。

3.1 传统培养基法与不依赖培养基法的比较

传统培养基筛选法是最常用于母乳微生物分离的方法，优点是可得到分离的菌株进行鉴定和计数，还可进一步研究，但操作复杂、耗时，且该方法的检测结果一定程度上取决于母乳样本的新鲜程度，若存在交通不便和样品转运不及时，则不能使用这种方法。不依赖培养基法即分子生物学分析方法，近年来被用于母乳微生物的测定，该方法可使用冷冻保存的母乳样本，可直接分析母乳中微生物DNA多样性，从而获得微生物的种类与构成。此方法操作简单快速，但无法分离得到细菌菌株。

上述检测母乳微生物的分析方法各有优劣，传统的培养基筛选可分离得到相应的菌株且可对菌株作后续研究，而分子生物学的方法分析快速、简便。因此选择何种方法取决于研究目的。在2015年前，使用不基于培养基技术，如聚合酶链式反应(polymerase chain reactions，PCR)等检测母乳菌群组成的研究相对较少，近年来PCR技术逐渐成为检测母乳菌群的主流技术。

3.2 分子生物学分析方法的应用

宏基因组技术的成熟催生了2008年前后展开的人类宏基因组研究计划。该计划为微生物菌落生态学的复兴奠定了坚实技术基础。例如，在Hunt等[2]的宏基因组测序研究中，收集并分析了16例哺乳期妇女的47份乳样，提供了较为全面的母乳细菌菌群测序数据。目前聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳/温度梯度凝胶电泳(PCR-denatured gradient gel electrophoresis/temperature gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE/TGGE)、定量即时PCR(quantitative real time- PCR，qRT-PCR)和454焦磷酸测序等分子生物学方法已被用于分析人乳微生物种类与构成。

3.2.1聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳/温度梯度凝胶电泳

利用PCR-DGGE/TGGE方法，根据数据库的比对结果可分析母乳中微生物的种属及其亚种，Martin等[4]用PCR-DGGE分析了母乳中细菌多样性，从4个人乳样品中共检出20多种细菌，如人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、唾液链球菌等。然而采用qRT-PCR却只能分析出复杂样品内某一群微生物及数量，如Martin等[32]用该方法分析了母乳中总细菌和双歧杆菌的数量，比较了母乳和婴儿粪便细菌组成的差异，Collado等[5]分析了母乳中细菌菌落的多样性。而454焦磷酸测序具有高通量、快速、准确和灵敏度高等特点，已被应用于多种微生物种类的分析，如Hunt等[2]用该方法证明母乳中存在沙雷氏菌属、罗尔斯通菌属和鞘氨醇单胞菌属。

3.2.2定量即时聚合酶链式反应

由于qRT-PCR需要依赖标准曲线来定量，而且会造成较低丰度的DNA定量的不精准，Qian等[24]比较了用数字微滴式(droplet digital)PCR和qRT-PCR检测中国人乳中的乳酸菌和双歧杆菌，发现不需要校准曲线的数字微滴式PCR的检出限比另一种方法提升了十多倍，且两种技术的检测结果有较好的相关性和一致性。

基因组学、环境基因组、转录组学、蛋白组学、代谢组学等组学方法用于人乳和乳腺中微生物的研究也在进行中，这些结果将有助于更好地了解人乳中存在的微生物种类和多样性。这些不基于培养的、高通量分子手段的应用，使人们得以探究之前并不广为人知的人乳微生物组学[33]。随着组学研究的不断深入，未来将会有更多的组学技术被用来研究人乳微生物[11]。

4 展望

在母乳喂养儿的早期免疫系统启动和肠道成熟方面，母乳的细菌多样性发挥了重要作用。目前的研究尚存在一定局限：人乳微生物研究多是横断面观察研究，且基于16S rRNA扩增测序，在测量较低生物量的样品(如乳样)时，易受试剂污染的影响，且不能鉴别细菌是否存活。建议未来重点研究人乳微生物菌群组成及与喂养儿健康状况的关系，包括：①人乳中细菌的多样性、活性与功能的鉴定；②不同泌乳期乳汁中细菌菌群丰度和多样性的变化及影响因素；③微生物中其他成分，如母乳中病毒或真菌及其毒素的含量以及对喂养儿健康状况的影响；④人乳微生物组成与母亲和婴儿免疫系统交互影响的评价，以及这些微生物如何影响喂养儿的健康状况；⑤通过系统的实验方法和恰当的试验模型，研究人乳微生物的功能作用；⑥特殊医学状况下的母乳微生物组学，及捐赠母乳对早产儿肠道菌群的影响仍待探寻。通过这些深入研究，可揭示在生命最初1 000天母亲-微生物-婴儿间的相互作用、人乳微生物群的功能以及对母婴健康状况的近期与远期效应。