针刺治疗对CUMS抑郁大鼠行为学和血清代谢组学的影响

徐雪娇，李天英，田家华，李欣，刘俊麟，马芸瑄，乔延盈，孙谦

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

抑郁症作为一种严重影响患者生活和工作的神经精神疾病，其发病率呈逐年上升趋势，人们对其治疗越发重视[1-3]。西药治疗具有耐药、副作用大等特点，寻找有效安全的治疗方法刻不容缓。《黄帝内经》中《灵枢·癫狂》篇记载了采用针刺放血的方法治疗情志病。目前临床上针刺治疗抑郁症具有较好的临床疗效[4-6]，但机制不清。百会穴位于颠顶，为督脉上的穴位，总督人体一身阳气，为调节人体阴阳平衡的要穴，主治癫狂痫类病证。印堂穴位于眉心，为经外奇穴，具有调畅气机，养心安神之效。临床上常用百会和印堂治疗抑郁症[7-9]。

近年来，CUMS模型广泛应用于精神疾病的研究中[10-11]，它能够模拟人类在社会环境中的各种不可预见性应激。代谢组学作为能够检测内源性小分子代谢物的技术手段，广泛地应用于各种体液以及组织的检测[12-13]。本实验采用GC-MS平台，检测血清样本，探寻针刺治疗对CUMS大鼠血清代谢的影响，并试图阐明相关代谢途径。

1 材料和方法

1.1 动物

将所有SD大鼠(雄性)单笼饲养，提供标准动物饮食和饮水以及饲养环境。

1.2 实验过程

见图1，所有大鼠练习饮用蔗糖水(2%)，每周进行1次SPT。在第0周，将18只大鼠分成12只CUMS，其余为对照。CUMS进行为期4周的造模，对照组正常喂养即可。每周进行SPT，将CUMS分为CUMS组(6只)与针刺组(6只)，针刺组进行治疗，SPT每周进行，第7周结束时进行OFT。

图1 实验过程图

1.3 造模流程

具体操作有禁水，空瓶，白噪音，湿垫料等，连续2 d采用不同的刺激方法[14]。

1.4 行为学

1.4.1 糖水消耗实验

糖水消耗实验(SPT)测定每只大鼠在24 h内饮用蔗糖水占总饮水量的百分比。见图1。

1.4.2 旷野实验

旷野实验(OFT)旷野箱为黑色开放式长方体(100 cm×100 cm×40 cm)。将所有大鼠依次放置在角落，放入大鼠前将前一只大鼠粪便及尿液清理干净。每只大鼠有30 s的适应时间，视频计算机跟踪系统(SMART,Panlab SL,Barcelona,Spain)记录5 min运动总距离和中心运动时间。

1.5 针刺

使用华佗针具针刺印堂和百会，刺入约5～6 mm，停留15～20 min[15]。

1.6 取材

戊巴比妥麻醉，采血，室温下静置30 min，3 000 r/min离心10 min，吸取上清到EP管中，存放于-80 ℃冰箱。

1.7 代谢组学

1.7.1 样品准备

将血清样本从-80 ℃冰箱中取出，解冻，50 μL血清移至1.5 mL EP管中并加入20 μL的内标后持续10 s使其摇匀，再加入150 μL甲醇-乙腈混合溶液(2∶1, v∶v)，持续1 min摇匀，使蛋白充分沉淀后，于-20 ℃静置约10 min。冰水浴超声持续5 min，此时取100 μL上清，挥干样品；加入15 mg/mL的甲氧胺盐酸盐吡啶80 μL，涡旋震荡后进行肟化反应。

1.7.2 色谱

本实验选用安捷伦公司仪器。衍生化后将样品进行分析(1 μL)。分离采用毛细管柱，下一步质谱分析。

1.7.3 质谱

质谱检测温度为安捷伦仪器默认温度。SCAN：m/z 50～600。

1.8 数据分析

采用SPSS 24.0，P<0.05具有统计学意义。数据处理后导出矩阵，可获得基本数据。再导入程序。样本间的分布情况和分析过程中是否稳定采用PCA分析，(O)PLS-DA区分各组代谢差异。还需进一步检验模型的过拟合程度。

2 结果

2.1 针刺对SPT和OFT的影响

4周CUMS造模结束后，造模大鼠SPT显著降低(P<0.01)。3周针刺后，CUMS+针刺组与CUMS组相比，糖水消耗和旷野中心运动时间显著提高(P<0.01)。CUMS+针刺组与对照组相比，糖水消耗与旷野中心运动时间无差异。3组的旷野运动总距离无差异。见图2、3，表1、2。

注:4周刺激后，与对照组相比，**P<0.01;针刺治疗结束后，与CUMS组相比，##P<0.01图2 糖水消耗实验结果

表1 糖水消耗值比较

表2 旷野运动总距离和中心运动时间

2.2 针刺CUMS大鼠血清代谢组学的变化

如图4，PCA显示组间区分。进一步采用PLS-DA和OPLS-DA分析以最大程度地区分。OPLS-DA表明组间的代谢表型具有显著差异。R2X=0.263,R2Y=0.952,Q2=0.75，表明该模型可信。通过OPLS-DA负载图我们得到具体差异，共77种。我们首先找到CUMS组与对照组之间存在显著差异的代谢物，再将这些代谢物在CUMS组与CUMS+针刺组中比较，若经过针刺治疗后无差异，则表明针刺能够将这些差异代谢物逆转。针刺治疗CUMS大鼠结束后，血清中L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、吲哚乙酸和牛磺酸水平得到了逆转。见表3。

图4 PCA示意图

表3 血清差异代谢物

2.3 相关代谢通路

代谢数据库和基因组数据库将逆转代谢物与通路相关联并确定影响因子。主要参与：①丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢；②牛磺酸和低牛磺酸代谢；③甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；④氨酰基-tRNA生物合成；⑤D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，如图5、6。

图5 影响因子

图6 相关代谢通路示意图

3 讨论

本研究成功造模后采用针刺手段进行干预，经过治疗后，抑郁大鼠的行为学得到了显著的改善，表明针刺治疗能改善抑郁焦虑行为。检测三组血清，找到差异代谢物。其中6种代谢物针刺后发生逆转：L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、吲哚乙酸和牛磺酸。逆转的代谢物主要分为3大类：氨基酸类(L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸)，吲哚基羧酸(吲哚乙酸)和有机磺酸(牛磺酸)。氨基酸代谢异常在抑郁症中较为常见。DENG等[16]在研究抑郁症发生机制中，对食蟹猴抑郁模型进行代谢组学研究，发现脑脊液中苏氨酸、丝氨酸和天冬氨酸代谢紊乱。有文献报道在肾上腺皮质激素诱导的抑郁鼠尿液中L-苏氨酸代谢紊乱，这种改变在甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径中起关键作用[17]。谷氨酸作为兴奋性神经递质的重要组成，它的代谢在抑郁症中发挥重要作用[18-19]。我们的研究表明，针刺可能通过降低谷氨酸的兴奋性发挥抗抑郁作用。牛磺酸是一种β氨基酸，参与渗透调节，信号转导和神经传递调节等生理活动。已经证实牛磺酸对大脑发育有保护作用，饮食中牛磺酸的含量与抑郁症的调节具有相关性[20]。在疏肝和胃汤的抗抑郁研究中，抑郁组大鼠下丘脑中吲哚乙酸含量显著降低[21]。本研究中抑郁组大鼠血清中吲哚乙酸含量升高，在某种程度上反应了抑郁大鼠中枢与外周吲哚乙酸含量可能存在差异，提示我们在下一步工作中可同时检测针刺对中枢和外周代谢水平的调节。本研究通过对逆转代谢物参与代谢通路的研究，发现针刺可能是调节了血清中氨基酸合成、氨基酸代谢与牛磺酸代谢。通过代谢平台找出针刺逆转的血清代谢物及其参与的代谢途径。接下来，我们将研究针刺对CUMS大鼠脑组织代谢的影响并结合中枢与外周代谢数据进行分析，从而完善针刺治疗的相关数据。