芪黄补肾泄浊方对肾小球系膜细胞Nrf2/HO-1信号通路的影响

金丽霞,金丽军,栾仲秋,潘超,马艳春*

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040; 2.黑龙江牡丹江市肿瘤医院头颈乳腺一科，黑龙江 牡丹江 157000; 3.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病临床常见而且相对比较严重的微血管并发症，也是慢性肾衰竭的常见病因[1]。DN病理多主要表现为系膜细胞不同程度的增生、肾小球硬化伴有不同程度的肾间质纤维化[2]。糖尿病肾病的发病机制是多方面相互作用的复杂结果，主要机制局部RAAS系统激活、糖代谢紊乱、晚期糖基化产物、异常细胞因子、氧化应激反应、遗传因素等[3]。但是确切的机制还需要进一步研究。高血糖可介导相关信号通路活化，进而加重氧化应激反应，大多数学者认为该机制在糖尿病引起肾脏损伤加重和发展中起到重要作用。既往研究表明[4]，Nrf2/ARE通路是重要的内源性抗氧化应激通路，其中核因子红细胞衍生2相关因子/血红素氧合酶(Nrf2/HO-1)是细胞内抗氧化应激非常重要的通路之一。对于糖尿病肾病的进展起重要作用[5]。

芪黄补肾泄浊方主要由黄芪、酒蒸大黄、蒲公英、猫须草、积雪草、丹参、生牡蛎、淫羊藿、菟丝子等药物组成，是在多年临床实践中不断总结的经验方，一直应用于临床，是治疗糖尿病肾病的有效方剂，疗效确切。芪黄补肾泄浊方治疗糖尿病肾病的临床应用显示芪黄补肾泄浊方能显著改善糖尿病肾病患者的临床症状、体征及相关实验室指标，且无任何毒副作用。既往系统的实验研究也进一步验证了芪黄补肾泄浊方抗肾小球硬化和延缓糖尿病肾病进展的作用机制，这无疑给更多的临床糖尿病肾病患者带来防病治病的希望，将极大的减轻社会和患者家庭的沉重负担。该项目的开发和应用，将进一步为临床治疗提供依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

健康的Wistar大鼠60只，雄性，购自黑龙江中医药大学药物安全性评价中心，动物许可证号：SYXK(黑)2013-011。实验细胞：人肾小球系膜细胞购自上海富衡生物科技有限公司。

1.2 实验药物

芪黄补肾泄浊方主要由黄芪、酒蒸大黄、蒲公英、猫须草、积雪草、丹参、生牡蛎、淫羊藿、菟丝子等药物组成，由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室制备。

1.3 主要实验仪器和试剂

仪器：电热恒温培养箱，型号DH36001B，天津泰斯特公司。超纯水系统，型号NW10LVF，中国Heal Force公司。显微镜及拍照系统分别为型号BX53及DP73，均购自日本OLUMPUS公司。试剂：HO-1购自Wanleibio公司，产地中国，货号WL02400。Nrf2 购自Wanleibio公司，产地中国，货号WL02135。生物素标记山羊抗兔IgG购自Beyotime公司，产地中国，货号A0277。辣根酶标记链酶亲合素购自Beyotime公司，产地中国，货号A0303。TritonX-100购自Beyotime公司，产地中国，货号ST975。DAB显色液购自Solarbio公司，产地中国，货号DA1010。

1.4 主要配制试剂及其配制方法

0.1%TritonX-100：1 μLTriton×100溶于1 mLPBS中，充分混匀。0.1 M PBS：将29 g Na2HPO4与3 g NaH2PO4及85 g NaCl充分在 500 mL蒸馏水中溶解，并1 000 mL定容。0.01 M PBS：上述0.1 M PBS 100 mL与900 mL蒸馏水充分融合，再加入0.5 mL Tween-20混合后，用NaOH将酸碱度调节至pH7.2～7.4。

苏木素：将0.4 g苏木精加入50 mL无水乙醇中溶解备用，2 g硫酸铝加入150 mL蒸馏水溶解，将配置两者的溶液混匀，加热沸腾后加入0.1 g碘酸钠和0.2 g柠檬酸，冷却至室温。

2 实验方法及步骤

2.1 HMC的培养和传代

将HMC细胞株复苏后，将细胞悬液以5×105个/mL接种于培养瓶中，置于37 ℃，5% CO2恒温培养箱培养，每1～3 d换液1次，细胞生长至融合状态，即可传代。本实验选用3～10代的细胞。

2.2 芪黄补肾泄浊方含药血清的制备

将Wistar大鼠60只适应性喂养1周后，随机分为5组，即正常对照组、高糖组、芪黄补肾泄浊低、中、高剂量组，芪黄补肾泄浊低剂量组按0.243 g/(kg·d)、芪黄补肾泄浊中剂量组按0.486 g/(kg·d)、芪黄补肾泄浊高剂量组按0.972 g/(kg·d)的芪黄补肾泄浊方灌胃给药，正常对照组及高糖组均给予与芪黄补肾泄浊方同等剂量的生理盐水灌胃，各组大鼠灌胃每日1次，连续灌胃给药1周。在末次灌胃后2 h麻醉，无菌操作腹主动脉采血，3 000 rpm×15 min离心后取血清，56 ℃水浴灭活补体30 min，经0.22 μm孔径的针头滤器过滤除菌，分装后-20 ℃冰箱冻存备用。

2.3 实验分组及药物处理

实验分5组，即正常对照组(A组)、高糖组(B组)、芪黄补肾低(C组)、中(D组)、高剂量组(E组)。A组HMC给予正常大鼠血清的培养液(血清浓度10%)培养，B组HMC予含正常大鼠血清的高糖培养液(血清浓度10%)培养，C组予含芪黄补肾泄浊方低剂量含药血清的高糖培养液(血清浓度10%)培养干预，D组予含10%芪黄补肾泄浊方中剂量含药血清的高糖培养液(血清浓度10%)培养干预，E组予含10%芪黄补肾泄浊方高剂量含药血清的高糖培养液(血清浓度10%)培养干预。

2.4 免疫细胞化学法检测Nrf2和HO-1的表达

0.1%TritonX-100孵育，3%过氧化氢孵育，血清封闭，一抗孵育，二抗孵育，辣根酶标记，DAB显色，苏木素复染，镜检。

2.5 Western blot测定各组系膜细胞中Nrf2和HO-1蛋白的表达

蛋白质的抽提：首先在室温下融化本实验所需要的裂解液，把裂解液按实验所需分装，分装后加入体积1%的PMSF混合后留置备用。根据实验不同指标样本加入适当体积的裂解样本，在冰上静置5 min。4 ℃条件下，用低温冷冻离心12 000 rpm×10 min，分离上清即为所需的蛋白质抽提物。

蛋白质定量：将待测样本蛋白抽提物与PBS缓冲液按1∶19混匀制备成蛋白质待测液。BCA反应：将A液：B液体积比50∶1配制好，加入各孔中，充分混匀后，放于37 ℃环境下反应20 min，溶液由绿色变为紫色。数据读取：设定酶标仪读取波长为570 nm，记录吸光OD值(A)。

2.6 Real-time PCR定量分析HO-1mRNA表达

各组细胞样本提取总RNA后，使用紫外分光光度计NANO 2000测定各样本中RNA的浓度。反转录：将上述所得到的RNA样本进行反转录以得到对应的cDNA。实时荧光定量分析,引物序列见表1。

表1 RT-PCR 引物序列

2.7 统计学分析

3 结果

3.1 Nrf2、HO-1的表达结果

各组细胞培养48 h末免疫细胞化学法检测Nrf2、HO-1的表达结果比较，与A组比较，B组细胞内Nrf2、HO-1的表达较A组减少，与B组比较，C组、D组及E组细胞内Nrf2、HO-1的表达增多，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见图1、2。

图1 各组细胞培养48 h末免疫细胞化学法检测Nrf2表达结果

图2 各组细胞培养48 h末免疫细胞化学法检测HO-1表达结果

3.2 Western blot测定各组系膜细胞中Nrf2、HO-1蛋白的表达

各组细胞培养48 h末Western blot测定各组系膜细胞中Nrf2、HO-1蛋白的表达结果比较，与A组比较，B组细胞内Nrf2、HO-1的表达减少，与B组比较，C组、D组及E组细胞内Nrf2、HO-1的表达增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见表2，图3、4。

表2 Western blot测定各组细胞中Nrf2、HO-1蛋白的表达

图3 Western blot测定各组细胞培养48 h末Nrf2及HO-1蛋白的表达

注：与A组比较,#P<0.05;与B组比较,*P<0.05图4 Western blot测定各组细胞培养48 h末Nrf2及HO-1蛋白的表达

3.3 Real-time PCR定量分析HO-1mRNA表达

本研究分析方法利用2-△△CT方法。本实验每种样本每个基因平行实验进行4个复孔，利用2-△△CT方法分析数据,见表3，图5。

表3 各组HMC48 h末HO-1表达相对值比较

注：与A组比较,# P<0.05;与B组比较,*P<0.05图5 各组细胞培养48 h末 HO-1mRNA表达

Real-time PCR结果显示，各组细胞HO-1mRNA在正常对照组可有少量表达，高糖刺激48 h后高糖组较对照组表达减少，不同剂量芪黄补肾泄浊方药物血清刺激后表达增加，且以中剂量组和高剂量组表达增加更明显，芪黄补肾泄浊方可通过上调高糖刺激下HMC中HO-1mRNA的表达，延缓DN的进展。

4 讨论

DN为一种较为常见的糖尿病慢性微血管并发症[6]，是引起终末期肾脏病的重要原因，一些西方国家如欧美、日本等的统计资料显示，DN已经成为引起慢性肾衰竭的第一位病因[7]。我们国家DN 的发病率也在不断升高。由于DN临床症状不典型，容易不被引起注意，且病情发展迅速，往往确诊时已处于不可逆阶段，并很快进展到终末期肾脏病。目前临床上对DN治疗效果不理想，尚没有特效的治疗手段。预后仍然是目前临床医生亟待解决的难题。如何提高临床早期诊断率，早期采取积极有效的治疗，延缓或逆转糖尿病引起肾脏损伤是很多科研人员和一线医生共同面对的重要课题。

虽然糖尿病进展至肾脏损伤的发病机理还不是很清楚，但是越来越多的实验结果表明体内高血糖以及由此产生的氧化应激与糖尿病肾脏损害有着密切的关联。氧化应激是各种有害因素损伤机体后，氧化应激系统之间失衡，导致细胞或组织的病理性损害。DN是DM主要的微血管并发症，氧化应激在 DN的发病中起到关键作用。体内持续存在的高血糖状态会产生大量的 ROS， ROS肾实质细胞中的蓄积可进一步引起肾脏内基质重构、组织纤维化，促进 DN 的发展[8]。Nrf2/HO-1信号通路是细胞内抗氧化应激最重要的通路之一，因此，调控Nrf2/HO-1信号通路有可能成为防治DN的新靶点。

Nrf2是Nrf2/HO-1信号通路的关键因子之一，也是其中枢调节者，Nrf2是近年来新发现的核转录因子，其具有碱性亮氨酸拉链结构，能够识别ARE元件并与其结合，进而转录表达一系列抗氧化应激酶类或二相解毒酶，起到保护氧化应激引起的器官损伤。Nrf2是调节细胞内抗氧化物表达的关键蛋白因子，对细胞内氧化与抗氧化平衡起着重要的调节作用，具有抑制细胞凋亡、神经保护和抗炎症反应等作用[9-10]。Nrf2作为一种转录因子，可以对各种抗氧化酶和II期解毒酶的不同基因进行激活编码，从而达到抗氧化应激和清除ROS的作用[11]。生理情况下，Nrf2是结合其抑制剂Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)，保留在细胞质中[12]无转录活性。当受到相关因素刺激的情况下，Nrf2会从Keap1解离，导致Nrf2入核，引起抗氧化反应元件(ARE)转录活化调节基因，其中包含血红素加氧酶1(HO-1)[13]。HO-1是由其调节的下游非常重要的酶，形成Nrf2/HO-1途径。HO-1可以降解血红素，是一种应激诱导型和氧化还原敏感性蛋白，从而有间接抗氧化的作用[14]。

Nrf2作为一种重要的转录因子，可以减轻氧化应激引起的器官损伤，在外界因素引起机体氧化应激损伤时，可以诱导启动细胞保护基因的表达，激活Nrf2能够缓解肾脏纤维化、肾缺血再灌注损伤等，是一个强有力的转录激活剂。HO-1也是机体内对氧化应激损伤起重要保护作用的一种抗氧化物酶蛋白，抗氧化能力非常强大。既往相关研究已表明在炎症级联反应中NF-κB是一个非常重要的调控因素， Nrf2/HO-1 通路与 NF-κB通路又存在着密切的关联，Soares等[15]相关研究表明HO-1是Nrf2信号通路与NF-κB信号通路枢纽因子，通过激活Nrf2通路可以上调HO-1的表达，能减轻机体的炎症反应。研究结果也表明Nrf2/HO-1通路在体内承担着重要的调节抗氧化应激反应的功能，转位进入细胞核的被激活的Nrf2，与ARE作用后上调HO-1抗氧化酶表达水平及活性，发挥抗氧化作用[16]。

本研究结果中免疫细胞化学及Western blot结果显示，正常大鼠血清的培养液培养的人肾小球系膜细胞可以少量表达Nrf2 及 HO-1，加入高糖刺激后Nrf2 及 HO-1表达减少，加入不同剂量的芪黄补肾泄浊方药物血清后，Nrf2 及 HO-1表达增加，通过Real Time PCR进行检测，结果显示芪黄补肾泄浊方可升高HO-1mRNA的表达，活化Nrf2/HO-1通路发挥抗氧化应激的作用。

综上所述，氧化应激反应在DN发生发展中起重要作用，芪黄补肾泄浊方可增加高糖培养下人肾小球系膜细胞Nrf2及 HO-1的表达。我们推测芪黄补肾泄浊方可通过调节 Nrf2/HO-1信号通路减轻氧化应激反应，从而缓解DN,为芪黄补肾泄浊方进一步临床应用提供实验依据。