湖羊乳腺上皮细胞的分离培养与鉴定

2020-08-13余方白周占琴

兽医导刊 2020年2期

关键词：湖羊培养皿培养液

余方白周占琴

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100）

关键字：乳腺组织细胞鉴定

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物。湖羊乳腺组织样采自杨陵上落手屠宰场，屠宰后立即将乳腺组织样品置于预冷、灭菌、加双抗的PBS缓冲液（AA-PBS）中，封口膜封闭后1h内带回实验室，进行乳腺上皮细胞的分离培养。

1.2 试验方法

1.2.1 湖羊乳腺上皮细胞的分离培养与纯化。将乳腺组织带回实验室，用酒精消毒并撕下封口膜，在超净工作台（苏州安泰公司）把组织放入培养皿中，去除结缔、脂肪等组织结构，用AA-PBS多次清洗乳腺组织，直至溶液变得透明，没有奶渍。然后将组织切片切碎成大约1mm3的立方体，用AA-PBS冲洗几次，室温保存2～3min，弃去上清、留下沉淀。将小块组织置于培养皿中，在37℃、饱和湿度和5 % CO2条件下反向孵育。30min后，用移液枪向培养皿中加入2ml含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培养液。培养液每48h更换一次，直到细胞从组织中迁移出来，并明显地散布在培养皿的底部。根据Shi等人的研究，培养约传至第5代，获得MECs。

本试验利用胰酶对乳腺上皮细胞和成纤维细胞对消化时间的不同进行纯化，即利用成纤维细胞相对于上皮细胞对胰酶更加敏感，容易脱落的原理进行分离纯化。先用25%的胰酶（含EDTA）消化贴壁细胞，在倒置显微镜（日本Nikon公司）下观察，等全部细胞回缩后，添加含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培养液立即终止消化，并进行吹打，将没有消化下来的细胞继续培养，如此反复三次即可得到纯的乳腺上皮细胞。

1.2.2 湖羊乳腺上皮细胞的鉴定。本试验利用免疫荧光化学方法对湖羊乳腺上皮细胞进行鉴定。具体步骤包括：爬片、清洗、固定、透化、封闭、一抗孵育、二抗孵育、染色、封片、观察。

2 结果与分析

2.1 湖羊乳腺上皮细胞的分离培养

通过组织块贴壁法培养处理后的湖羊的乳腺组织样，培养至第 10 天左右有大量细胞迁出，此时细胞形态不单一，消化迁出细胞，纯化3-5次直至得到单一形态细胞，显微镜拍照，经与前人研究的细胞状态，形态对比，发现所得到的的细胞之前研究所描述的乳腺上皮细胞一致，如图2-1即可确定本研究获得了纯化的湖羊乳腺上皮细胞。

2.2 湖羊乳腺上皮细胞的鉴定

本研究运用免疫荧光化学法鉴定湖羊乳腺上皮细胞。将所得到的湖羊乳腺上皮细胞经转染处理后，再经过48 h的培养，如图2-2A观察发现上皮细胞呈现出半汇合的单层上皮细胞样，细胞核被DAPI染为蓝色（图2-2B），呈上皮细胞特有的角蛋白阳性（图2C），说明本试验培养的贴壁细胞为湖羊乳腺上皮细胞。

图2-1 湖羊的乳腺上皮细胞Fig 2-1 Mammary epithelial cells of Hu sheep

图2-2 湖羊乳腺上皮细胞免疫荧光鉴定

3 讨论

乳腺上皮细胞培养技术应用于许多研究领域，例如泌乳机理，乳成分的生物合成，一些miRNA、激素以及功能基因等对乳腺上皮细胞的调控作用。在此之前的研究报道中对于乳腺上皮细胞培养的方法多为组织块培养法和胶原酶消化法，以及两种方法联合。每种方法各有长处，可根据研究目的和要求进行选择。本试验采用组织块细胞培养法来获得所需细胞，经过3～5次传代纯化，可获得单细胞层、鹅卵石岛屿状结构的细胞，经过免疫荧光技术鉴定可确定为湖羊乳腺上皮细胞，与前人研究结果一致。此方法只需用经过胰蛋白酶的消化处理，因此能够获得活性高且生长状态良好，细胞活力旺盛的细胞，这为下一步试验的功能探究奠定基础。