磷霉素（R）-1-苯乙胺盐合成工艺的优化

李 雪，金学平，曾祥聪，李 爽，李 丽，余 磊，朱伶俐，周 委，祝 宏*

1.武汉工程大学化工与制药学院，绿色化工过程教育部重点实验室（武汉工程大学），新型反应器与绿色化学工艺湖北省重点实验室（武汉工程大学），湖北 武汉430205；

2.武汉市药物增溶工程技术研究中心，湖北 武汉430205；

3.武汉软件工程职业学院，湖北 武汉430205

磷霉素（R）-1-苯乙胺盐是磷霉素类药物的关键中间体，包括磷霉素钙、磷霉素钠以及磷霉素氨丁三醇［1-3］。磷霉素类药物主要用于敏感菌所致的单纯性下尿路感染和肠道感染，通过与细菌烯醇丙酮酸转移酶不可逆结合，抑制其活性，阻断N-乙酰葡糖胺和磷酸烯醇丙酮酸合成N-乙酰胞壁酸，干扰细菌细胞壁的合成，发挥广谱抗菌作用［4-5］。多重耐药菌的出现和流行使临床抗感染治疗面临日益严峻的挑战［6-8］，磷霉素抗菌机制独特，交叉耐药少，对于多种临床重要耐药菌仍有较高的抗菌活性，再度得到临床医师的重视［9-10］。

原研工艺采用Glamkowski合成法，进行手性拆分生产磷霉素（R）-1-苯乙胺盐，收率达32.5%，该工艺存在混旋盐拆分过程操作繁琐、能耗大，拆分技术不易掌握，收率不稳定等问题［11-12］。近年来有文献相继报道了以钨酸钠或钼酸钠催化顺丙烯膦酸-（R）-（+）-α-苯乙胺盐环氧化合成磷霉素（R）-1-苯乙胺盐的工艺，收率在28%～30%，该类工艺解决了混旋盐拆分繁琐的问题，但收率并没有提升，且使用的催化剂存在回收困难，残留严重等问题，有着很大的改进空间［13-15］。

本文在上述基础上，以过氧树脂为载体，负载钨酸钠制备成高分子手性环氧催化剂R（图1），经验证具有良好的性能，并且能够多次重复套用；通过单因素试验和正交试验对合成条件进行优化，以顺丙烯膦酸为原料，反应温度、催化剂用量、原料物质的量之比、反应时间作为影响因素，收率、光学纯度作为评价指标，找到了最佳的合成方案［16-18］，解决了催化剂回收困难问题，提高了反应收率［19-21］；采用红外光谱，光学纯度分析，液相色谱法联用蒸发光散检测器（high performance liquid chromatography-evaporative light-scattering detector，HPLC-ELSD），核磁共振氢谱（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）对其进行质量分析［22-23］，该方案制备工艺简单、稳定、质量可控，适合用于工业化生产［24-25］。

图1磷霉素（R）-1-苯乙胺盐的合成路线Fig.1 Synthesis route of phosphonomycin（R）-1-phenylethylamine salt

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器；旋转蒸发仪RE-52C；ZF7三用紫外分析仪；RY-1熔 点 仪；AuTopolIV（365 nm）；Agilent-Cary630；Agilent1260Ⅱ。

1.1.2 试剂顺丙烯膦酸，（R）-（+）-α-苯乙胺，乙醇，质量分数30%双氧水，水合钨酸钠、Na2HPO4，以上（湖北迅达药业股份有限公司）；过氧树脂［赛乐成尔（武汉）科技有限公司］。

1.2 实验内容

1.2.1 催化剂R的制备称取50.0 g水合钨酸钠加至1 000 mL三口烧瓶中，加入500 mL纯化水搅拌至溶清，缓慢滴加50 mL的H2SO4（6 mol/L），得白色乳浊液，再滴加4.0 mL磷酸溶液（质量分数为85%）；向反应体系中加入过氧树脂50.0 g，剧烈搅拌并升温至60℃，反应8 h后降至室温，减压抽滤，滤饼用大量纯化水洗至滤液为中性，然后再用100 mL无水乙醇淋洗2次，将滤饼转移至鼓风干燥箱50℃至无减重，得亮黄色固体85.2 g，催化剂负载量为70.4%。

1.2.2 顺丙烯膦酸-α-苯乙胺盐的合成用量筒取50 mL（0.164 mol）顺丙烯膦酸溶液，加至250 mL三口瓶中，补加70 mL乙醇，匀速搅拌；缓慢匀速滴入（R）-（+）-α-苯乙胺21 mL（0.164 mol），控制温度低于40℃；滴加完毕，40℃恒温快速搅拌反应1.5 h，于零摄氏度以下抽滤，滤饼用环己烷（50 mL）洗涤3次，转移至鼓风干燥箱50℃至无减重，得灰白色固体38.72 g，收率97.1%。

1.2.3 磷霉素（R）-1-苯乙胺盐的合成在250 mL三颈瓶中，加入上步骤全部产物固体38.72 g（0.148 mol）的顺丙烯膦酸-α-苯乙胺盐和120 mL乙醇，搅拌并升温至45℃，直至固体全部溶清；在搅拌的条件下慢慢加入催化剂3.0 g（相当于顺丙烯膦酸质量的15%），Na2HPO40.12 g（相当于顺丙烯膦酸质量的6‰），然后用恒压滴液漏斗慢慢滴入质量分数30%的双氧水23 mL（0.197 mol），控制滴速约5秒/滴。滴加完毕，升温至65℃恒温反应3 h，趁热抽滤，回收催化剂，滤液送至冰箱冷冻析晶5 h，再次抽滤，滤饼送至鼓风干燥箱50℃干燥至恒重，得白色结晶状固体22.1 g，收率53.8%。［文献［11］：收 率32.5%DMF）］；1HNMR（400 MHz，D2O）δ：1.19～1.20（d，J=4.0Hz，3H，CH3），1.35～1.37（d，J=8.0Hz，3H，CH3），2.64～2.69（d，J=10.0Hz，1H，CH），3.01～3.08（m，1H，CH），4.23～4.27（m，1H，CH），7.19（s，5H，ArH）；IR（KBr）v：3 178.11，1 626.66，1 534.58，1 148.40，1 046.68，908.79，847.08，772.83，700.52 cm-1。

2 结果与讨论

2.1 工艺条件的优化

2.1.1 磷霉素（R）-1-苯乙胺盐的合成单因素试验经过大量预试实验，发现顺丙烯膦酸与（R）-（+）-α-苯乙胺的物质的量之比、成盐反应温度、催化剂的用量、反应时间对磷霉素（R）-1-苯乙胺盐的合成试验结果影响较明显；因此，以顺丙烯膦酸与（R）-1-苯乙胺的物质的量之比（n1∶n2）、反应温度（C）、催化剂用量（B）、反应时间（A）作为单因素考察条件，按上述实验内容进行试验，以收率（Y）和光学纯度（ee%）作为参考指标，探索该反应的较为合适的条件。单因素试验因素及试验条件见表1，实验结果见图2。

表1单因素试验因素及试验条件Tab.1 Factors and levels for single factor experiment

由图2可知，反应时间在2～3 h、催化剂用量在10%～20%、反应温度在55～65℃、原料顺丙烯膦酸与（R）-（+）-α-苯乙胺物质的量比为1∶1.0～1∶1.5之间时，产率较高。考虑综合成本，顺丙烯膦酸与（R）-（+）-α-苯 乙 胺 的物质 的 量 比 采用1∶1.1～1∶1.3作为最佳范围。

2.1.2 磷霉素（R）-1-苯乙胺盐的合成正交试验设计根据单因素试验结果，以收率（Y）、光学纯度（ee%）作为考察指标，选择四因素三水平正交表L9（34）进行正交试验设计，为了使试验数据的分析准确度进一步提高，随机设置各因素水平，用来安排正交试验设计的因素与水平，具体见表2。

图2单因素试验结果：（a）反应时间，（b）催化剂用量，（c）反应温度，（d）原料物质的量比Fig.2 Results of single factor experiment：（a）reaction time，（b）amount of catalyst，（c）reaction temperature，（d）molar ratio of raw material

表2正交试验设计因素水平Tab.2 Factors and levels for orthogonal test design

2.1.3 工艺条件优化的分析此步所有条件及操作不变，原料为第3步所得。实验结果见表3。

以50 mL母液（含顺丙烯膦酸20.0 g）为原料，按照1.2和表2的条件进行L9（34）正交实验，分别测定产品收率和对映体过量百分率e.e.值，进行多指标综合评分。在合成物质纯度较高的条件下，产率是合成条件优良与否的主要评价指标，因而设权重系数为0.7，e.e.值越低，则表明产物的光学纯度越低，所以设权重系数为0.3。以综合评价的结果进行极差分析和方差分析，结果见表3、表4和表5。

以综合评价为指标，在实验选取条件的范围内，以A、B、C、D四个因素作为变量，进行方差分析，无Sig.值和F值，D项的Ⅲ型平方和为0.137，远小于其他3个因素，所以将D因素作为误差项分析，不列入变量范围，再次进行方差分析，得到表5结果。

表3正交试验设计的结果Tab.3 Results of orthogonal test design

表4第一次方差分析结果Tab.4 First analysis results of variance

将D因素作为误差项进行分析，A、B、C三项的Sig.值分别为0.02、0.03、0.01，均小于0.05，可认为因素A、B、C对综合评价的影响显著，即反应时间、催化剂的用量、反应温度对综合评价指标影响显著，且影响强度：反应温度＞反应时间＞催化剂的用量；顺丙烯膦酸与（R）-（+）-α-苯乙胺的物质的量之比对综合评价指标几乎没有影响。根据极差分析结果和方差分析结果以及从节约成本、提升光学纯度等方面来判断，最佳的合成工艺条件为A3B2C3D1，即反应时间3.0 h，催化剂用量质量15%，反应温度65℃，顺丙烯膦酸与（R）-（+）-α-苯乙胺的物质的量为1∶1.0。

2.2 催化剂R活性验证

参照实验1.2.3，以最佳的合成工艺条件（即反应时间3.0 h，催化剂用量质量15%，反应温度65℃，顺丙烯膦酸与（R）-（+）-α-苯乙胺的物质的量为1∶1.0）进行重复性实验，并将粗品以质量分数80%乙醇-水溶液精制，烘干得产出精品经HPLC检测纯度达99%以上视为合格，其中催化剂R经重复利用5次。实验结果见表6。

根据表6数据可知，该步反应平均收率为48.7%，催化剂R重复套用5次，其催化活性基本上保持一致，很好的解决了催化剂难以回收的问题。

表6催化剂R重复利用实验结果Tab.6 Experimental results for catalyst R recycle

表5第二次方差分析结果Tab.5 Second analysis results of variance

3 结论

本研究在原研工艺Glamkowski合成法的基础上，综合了近年来以钨酸钠或钼酸钠催化顺丙烯膦酸-（R）-（+）-α-苯乙胺盐环氧化合成磷霉素（R）-1-苯乙胺盐的工艺，通过修饰催化剂并改变投料比、反应时间、催化剂用量以及温度等实验因素，找到较优反应条件。

通过正交试验设计［L9（34）］，以产率和光学纯度为考察指标，利用综合评分法对试验结果进行方差分析可知，反应时间3.0 h，催化剂用量15%，反应温度65℃，顺丙烯膦酸与（R）-（+）-α-苯乙胺的物质的量为1∶1.0为磷霉素（R）-1-苯乙胺盐的最优合成条件。通过对上述条件的优化，以顺丙烯膦酸为原料制备磷霉素（R）-1-苯乙胺盐的综合收率达47.3%，与现有工艺（30%～35%）相比有所提升，并解决了催化剂难以回收的问题。此合成路线具有经济、易操作的特点，且易于实现工业生产。