纤维素和直链淀粉衍生物双选择体手性固定相的分离特性研究

张 珊，徐小琴，郝菊芳，何保江，柏正武*

1.武汉工程大学化学与环境学院，湖北 武汉430205;

2.中国烟草总公司职工进修学院，河南 郑州450008；

3.中国烟草总公司郑州烟草研究院，河南 郑州450001

自从Henderson和Rule［1］报道了在柱色谱中用乳糖作为手性吸附剂进行对映体分离以来，经过不断的探索与优化，多糖衍生物类手性固定相（chiral stationary phase，CSP）因其卓越的分离性能和廉价易得的制备原料而广受欢迎［2-4］。其中，纤维素［5-6］和直链淀粉［7-8］的衍生物表现出更为优越的分离性能。不同的多糖衍生物对同一种手性化合物的手性分离性能往往有很大差别。为了扩大手性色谱柱的应用范围，人们尝试制备双选择体CSP，期望弥补单选择体CSP在手性分离方面的不足。例如，Francotte等［9］将两种纤维素衍生物混合制备了双选择体CSP，研究结果表明，基于纤维素衍生物的双选择体CSP的手性分离性能介于两种相应的单选择体CSP的手性分离性能之间。本课题组也曾研究过纤维素及直链淀粉衍生物双选择体CSP［10-12］，发现了一些手性分离性能较好的双选择体CSP，虽然这些CSP的应用范围有所扩大，但总的来说分离性能没有得到大幅度的提高。沈军等［13］制备了直链淀粉及纤维素衍生物混杂的复合型CSP，与单选择体CSP相比，所制备的复合型CSP对一些手性样品有更好的分离性能。

在研究中，我们意识到对于多糖衍生物双选择体CSP来说，其手性分离性能的改善程度主要取决于多糖衍生物结构的组合，即用不同组合的多糖衍生物共混制备CSP，其手性分离性能的改善情况也不相同。一些用纤维素衍生物［如纤维素-三（对基甲苯甲酸酯），cellulose tris（4-methylbenozate），CMB］和直链淀粉衍生物［如直链淀粉-三（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯），amylose tris（3，5-dimethylphenylcarbamate，ADMPC）］制备的单选择体CSP有较强的手性识别性能，其手性固定相和色谱柱已经商业化。为发掘分离性能更强的双选择体CSP，本文将CMB和ADMPC以等摩尔（重复单元摩尔数）共混，以此共混物制备涂覆型CSP，考察其与相应单选择体CSP相比较手性分离性能提高的程度。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

对甲基苯甲酰氯、3-氨丙基三乙氧基硅烷（中国Aladdin试剂公司）；间二甲基苯异氰酸酯（中国濮阳宏大圣导有限公司）；手性样品由国内诸多生产企业友情赠送或购自希恩斯试剂公司（中国天津）；大孔硅胶（平均粒径7μm，日本Daiso公司）；用作色谱流动相的有机溶剂（中国国药集团化学试剂有限公司）。

安捷仑1100型高效液相色谱仪（美国安捷仑公司）；Vario EL III CHNOS型元素分析仪（德国Elementar公司）；奥泰克1666型色谱柱填充泵（美国奥泰克公司）；色谱柱（i.d.250 mm×4.6 mm，英国Hypersil公司）。

1.2 双选择体CSP的制备

1.2.1 CMB和ADMPC的制备按文献方法制备CMB［14］，产率96%，元素分析（%）：计算值C 69.77，H 5.43；实测值C 69.73，H 5.58。ADMPC在前期工作中制备，并对其进行了表征［12］，产率82%。

1.2.2 CSP的制备将3-氨丙基三乙氧基硅烷与大孔硅胶加入甲苯中，于95℃下反应过夜，用丙酮抽 提24 h，得 到 氨 丙基硅胶［15］。并 将0.565 1 g（1.09 mmol重复单元，下文同）CMB置于DMF（30 mL）中，搅拌至CMB完全溶解。取3 g氨丙基硅胶与10 mL CMB溶液相混合，减压下加热蒸干，完成一次涂覆，用余下的20 mL CMB溶液再进行两次涂覆，得到涂覆着CMB的固定相（CSP1）。同样地，将0.660 4 g（1.09 mmol）ADMPC涂覆于3 g氨丙基硅胶上，制得涂覆着ADMPC的固定相（CSP2）。将0.282 5 g（0.54 mmol）CMB和0.330 2 g（0.54 mmol）ADMPC加入30mL DMF中，搅拌，得到CMB―ADMPC混合液，用制备CSP1的方法，制得双选择体固定相（CSP3）。

1.3 手性柱的填充及色谱条件

将约为3.0 g的CSP置于30 mL正己烷/异丙醇（2/1，体积比，下同）中，超声，使之成为匀浆液，在38 MPa的压力下，以正己烷为顶替液，用填充泵将固定相压入空色谱柱中，制得手性柱。以联苯为样品、正己烷/异丙醇（90/10）为流动相，紫外检测器的波长设为254 nm，测试手性柱的柱效；以均三叔丁基苯为样品测定死时间（t0）；用乙醇配制手性样品溶液，其浓度为1 mg/mL，样品溶液用0.2μm滤头过滤，进样体积设置为10μL；在分析检测中，色谱仪的流速设为1.0 mL/min，柱温箱的温度设为25℃。色谱参数包括：保留因子（k1、k2）、分离因子（α）及分离度（Rs）。其中，k1=（tR1-t0）/t0、k2=（tR2-t0）/t0，tR1和tR2分别是先后被洗脱对映体的保留时间；α=k2/k1，Rs=2（tR2-tR1）/（w1+w2），w1和w2为两个对映体的峰宽。

2 结果与讨论

2.1 单选择体与双选择体CSP分离性能的比较

图1测试分离性能的手性样品Fig.1 Chiral analytes for testing enantioseparation capabilities

在相同的流动相条件下，用37种结构不同的手性样品（图1）对三种CSP的手性分离性能进行评价，表1列出了各CSP对各个手性样品在取得最大分离度条件下的色谱分离结果。如表1所示，单选择体固定相CSP1、CSP2分别识别了26和28种手性样品对映体，基线分离了其中的18和20种；CSP3识别了35种手性样品对映体，基线分离了其中的22种。从所手性识别和基线分离的手性样品数目来看，在分离性能方面，CSP2略好于CSP1，而双选择体固定相CSP3显著地比CSP1和CSP2有更好的分离性能。在37种手性样品中，有11种是手性药物（手性样品1-4、6、7、9-11、36和37），有4种是手性药物中间体（手性样品5、8、13和14），这些手性化合物均能被CSP3不同程度地分离，而手性药物（或药物中间体）8、10、13和36未被CSP1和CSP2分离，表明CSP3在手性药物分析中有实际应用价值。另外，还发现手性样品1-3、5、6、12、14、23、25和37在CSP3上能被更好地分离；而17、18和21号样品在CSP1和CSP2上有更大的分离度。

上述现象可能与双选择体固定相中两种选择体在手性识别中存在协同或者反协同的作用有关。当两种选择体共混后，每一选择体的高级结构在一定程度上仍然保持着原有的独立性，因CSP3上有纤维素和直链淀粉两种衍生物，它们各自能识别一定范围的手性样品，所以，CSP3的手性识别性能得到显著提高。另一方面，CSP3上的纤维素和直链淀粉衍生物之间又有相互作用，对其原有的高级结构会有一定的改变，而改变后的高级结构对一些手性样品的分离有利，表现出协同作用，同时也会对另一些手性样品的分离不利，就表现为反协同作用。究竟是协同作用还是反协同作用为主，就要取决于两种手性选择体在结构上的搭配。结果表明，CMB和ADMPC的组合适合用于制备双选择体CSP，这种CSP的分离性能得到明显增强。

2.2 流动相对双选择体CSP分离的影响

表2列出了CSP3在含不同醇的流动相中的手性分离结果。由表2可知，手性样品5、6、8、11、13、15、19、20、22、28、30、31和35在含异丙醇的流动相中分离度最大，在含乙醇的流动相中次之，在含混合醇［（V（甲醇）/V（乙醇）=1/1］的流动相中最小；7、10、14、16、17、21、23、24、34和36在含乙醇的流动相中分离度最大，在含混合醇的流动相中次之，在含异丙醇的流动相中最小；4、25、29和37在含混合醇的流动相中分离度最大，在含异丙醇的流动相中最小。

表2流动相*中醇的组成对CSP3分离结果的影响Tab.2 Influence of alcohol compositions in mobile phases on enantioseparations of CSP3

图2显示了25和31号手性样品在含异丙醇、乙醇和混合醇三种流动相中被CSP3分离的色谱图，在正己烷/异丙醇（90/10）的流动相中，25和31号化合物在CSP3上的分离度分别为7.14和4.10，而在正己烷/甲醇/乙醇（90/5/5）的流动相中，分离度则分别为10.6和3.35，流动相中的醇对这两个化合物的手性分离表现出相反的影响趋势。这可能是因为在手性分离中，流动相中的醇也参与手性样品的一对对映体与手性选择体之间形成两个非对映体的瞬时“复合物”，如果这两个“复合物”的稳定性不同就可能产生手性识别，而流动相中醇的结构和极性都会影响两个“复合物”的稳定性，所以，对于结构不同的样品适合在含不同醇的流动相中进行分离。

图2 25和31号手性化合物在CSP3上的分离色谱图Fig.2 Enantioseparation chromatograms of chiral compounds 25 and 31 separated by CSP3

3 结论

尽管一些纤维素及直链淀粉衍生物CSP有较强的对映体分离性能，但还是有不少手性化合物不能被这些CSP所分离，如果能用廉价的原料就能制备出手性分离性能更强的CSP将有重要的意义。纤维素及直链淀粉经过一步反应就能生成CMB和ADMPC，用它们的共混物制备而成的双选择体CSP比两种相应的单选择体CSP能识别和基线分离更多的手性样品，显示出非常好的手性分离性能，因而这种CSP有很好的应用前景。本文结果表明，CMB和ADMPC这种组合适合用来制备高性能的手性分离材料。此外，根据色谱分离结果，推测流动相中的醇可能参与了手性样品对映体与手性选择体之间的相互作用，所以醇的结构对CSP3的手性分离有较大的影响。