肺炎克雷伯菌的敏感性及其质粒介导的耐药基因的分布特点分析

翟俊斌 曹小利 程莉 周万青 张之烽 沈瀚

肺炎克雷伯菌是临床常见的主要机会性感染致病菌之一，治疗该细菌感染的临床常用药物有β-内酰胺类、氟喹诺酮类及氨基糖苷类等抗生素。随着这些药物的广泛使用，细菌由于超广谱β-内酰胺酶（CTX-M、TEM、SHV）[1]、AmpC酶（CMY、DHA、FOX、ACC-1、ACT/MIR和MOX）[2]、喹诺酮耐药酶（QnrA、QnrB、QnrC、QnrD、QnrS、OqxAB、Aac(6')-Ib-cr、QepA）[3]及16S rRNA甲基化酶（ArmA, NpmA, RmtA, RmtB, RmtC, RmtD和RmtE）等的产生[4]，对常用药物包括头孢菌素、喹诺酮类及氨基糖苷类等出现耐药，常导致临床抗菌药物治疗的失败。

分子流行病学研究表明，上述耐药酶大多由质粒编码，在抗生素的选择压力下，在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等肠杆科细菌中播散，导致细菌耐药性的增加[5]。目前已知，喹诺酮耐药基因oqxAB和16S rRNA甲基化酶rmtB与blaKPC-2一起在碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌中高度流行[6]，但这些基因的流行在碳青霉烯不敏感肺炎克雷伯菌（carbapenem-nonsusceptibleKlebsiella pneumoniae，CNSKP）和碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌（carbapenem-susceptibleKlebsiella pneumoniae，CSKP）中是否有差异仍不清楚。本研究旨在分析质粒介导的耐药基因在CSKP和CNSKP中的分布差异，为临床感控措施等的实施提供理论依据。

材料与方法

1 菌株收集 收集2014年1～8月我院保存的非重复分离的肺炎克雷伯菌115株。所有菌株均采用法国生物梅里埃公司生产的VITEK2鉴定仪或ATB鉴定系统鉴定。115株肺炎克雷伯菌中（经微量肉汤稀释法测定亚胺培南的MIC值后，依据CLSI2018年判定标准，抑菌圈直径≤1 mg/L为耐药、1～2 mg/L为中介、≥4 mg/L为敏感），碳青霉烯不敏感菌株为38株（包括35株耐药菌株和3株中介菌株），其样本分布为痰液17份、分泌物8份、胆汁4份、尿液3份、血液和腹水各2份，脓液和咽拭子各1份；77株碳青霉烯敏感菌株细菌为血液35份、尿液20份、分泌物8份、导管头7份、腹水4份、胆汁2份、脓液1份。

2 主要试剂及仪器 药敏纸片头孢噻肟(30 μg)、头孢噻肟/克拉维酸（30 μg/10 μg）、头孢他啶（30 μg）与头孢他啶/克拉维酸（30 μg/10 μg）为Oxoid公司产品；PCR引物由Invitrogen公司合成；2×PCR Master Mix、PCR产物纯化试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒均购自北京天根公司；Vitek2全自动细菌鉴定仪及ATB鉴定系统购自法国生物梅里埃公司。

3 药物敏感性检测 使用Vitek2仪测定细菌对氨苄西林/舒巴坦、阿米卡星、头孢他啶、头孢西丁、氨曲南、头孢吡肟、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、左氧氟沙星、复方新诺明的最低抑菌浓度（MIC），结果根据2018年美国临床和实验室标准化协会（CLSI2018）标准判定，大肠埃希菌ATCC 25922为质控菌株。

4 ESBL的表型筛选 用双纸片协同法筛查ESBL阳性菌株。按临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的标准纸片扩散确证法进行ESBL确证[7]。头孢噻肟（30 μg）与头孢噻肟/克拉维酸（30 μg/10 μg）、头孢他啶30 μg与头孢他啶/克拉维酸（30 μg/10 μg）两对纸片中任一对或两对加克拉维酸者比不加克拉维酸者抑菌圈直径≥5mm则判定为ESBL阳性。其中阴性质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922，阳性质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

5 抗生素耐药基因的筛选和鉴定 水煮法提取细菌基因组DNA。49株ESBL阳性菌株检测blaCTX、blaTEM、blaSHV[8]。46株对头孢西丁不敏感的菌株检测pAmpC（blaCMY-2、blaDHA、blaFOX、blaACC-1、blaACT/MIR和blaCMY-1、blaMOX）[8]。碳青霉烯耐药的菌株检测碳青霉烯酶基因blaKPC、blaOXA-48、blaIMP、blaVIM、blaNDM、blaDIM、blaSPM和blaSIM[9]。所有的菌株检测PMQRs（qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA和oqxAB）[10]，对阿米卡星耐药的菌株检测armA、npmA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和rmtE基因[11]。所有的基因均经过PCR扩增，耐药基因阳性的PCR产物进一步纯化送生工生物工程（上海）股份有限公司进行分析。测序结果使用Chromas-Pro软件（Technelysium，澳大利亚）进行初步分析，再使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）进行比对分析。

6 统计学处理 应用SPSS11.0软件进行统计分析。采用卡方检验（皮尔森或确切概率法）对质粒介导的耐药基因在CSKP和CNSKP中的分布差异进行分析。

结 果

1 抗菌药物敏感性 肺炎克雷伯菌对所测抗菌药物的不敏感率均在30%以上，对氨苄西林/舒巴坦、氨曲南和复方新诺明的不敏感率最高（＞50%）依次为61.8%、53.6%和50.9%；对头孢吡肟、头孢西丁、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦的不敏感性依次为44.5%、41.8%、37.3%和37.3%；对阿米卡星和亚胺培南的敏感性最好，分别为33.6%和34.5%。CNSKP菌株对所测抗菌药物的不敏感率显著高于CSKP菌株。其中，CNSKP对氨苄西林/舒巴坦、头孢西丁、头孢他啶、头孢吡肟及头孢他啶、氨曲南的耐药率均在86%以上，左氧氟沙星的耐药率为60.5%，对复方新诺明的耐药率为65.8%，阿米卡星的耐药率为44.7%；而CSKP对氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、阿米卡星和复方新诺明的耐药率较高（＞20%），耐药率依次为35.1%、29.9%、23.4%和40.3%。

2 抗菌药物耐药基因的分布及差异 耐药基因在两组中的分布见表1。115株肺炎克雷伯菌中，49株为ESBL阳性菌株，PCR和DNA测序分析显示blaCTX-M是最主要的blaESBL（测序图谱见图1），经DNA测序分析发现，blaCTX-M型ß内酰胺酶包括blaCXTM-14（n=23）、blaCXT-M-15（n=11）、blaCTXM-27（n=4）、blaCTX-M-142（n=4）、blaCTXM-9（n=2）、blaCTX-113（n=1）；31株细菌携带blaTEM-1；13株细菌携带blaSHV包括blaSHV-11（n=6）、blaSHV-1（n=3）、blaSHV-31（n=2）、blaSHV-12（n=1）和blaSHV-27（n=1）。46株对头孢西丁不敏感的肺炎克雷伯菌株中，8株细菌产DHA-1；38株CNSKP中，17株细菌携带blaKPC-2，1株细菌携带blaNDM-1。

表1 质粒介导的耐药基因在碳青霉烯不敏感和碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌中的分布及差异

115株肺炎克雷伯菌中，79株（68.7%）至少携带1个PMQRs基因。其中，20株（19.7%）携带qnrB变异体，包括10个qnrB10（n=10）、qnrB2（n=6）、qnrB6（n=2）、qnrB60（n=1）和qnrB66（n=1）。70株（60.9%）细菌携带oqxAB。对阿米卡星耐药的39株细菌分析发现7株（6.1%）携带16SRMTase编码基因。其中，3株细菌产rmtB，4株细菌产armA。其他的耐药基因均未检测到。总体上，37株（32.2%）细菌携带三种以上的耐药基因。3 统计学分析 统计学分析结果发现（结果见表1），blaCTX-M、blaTEM和rmtB基因在CNSKP组的分布显著高于CSKP组（P＜0.05），而oqxAB在CSKP组中的分布显著高于CNSKP组。

讨 论

CNSKP在全球范围内的播散和流行是威胁人类健康安全的重要问题。我们前期的研究发现，blaKPC-2基因在肺炎克雷伯菌中的播散和流行伴随着oqxAB和rmtB基因的高度流行[12]。基于blaKPC-2主要由质粒播散[13]，本研究中，我们重点分析了质粒介导的耐药基因在CNSKP和CSKP两组中的分布差异，以期阐释oqxAB和rmtB在CNSKP中的播散是否有一定的相关性。

本研究发现，CNSKP组的耐药率显著高于CSKP组，这与肺炎克雷伯菌对碳青霉烯的耐药机制有关，其中以碳青霉烯酶如KPC-2产生为主的酶对ß内酰胺类药物均耐药[13]，而外膜通透性的下降和外排泵的过表达等也会导致细菌对多种抗菌药物的耐药[14]。本研究中，38株CNSKP菌株中，有17株细菌产KPC-2，1株细菌产NDM-1，表明KPC-2是肺炎克雷伯菌最为主要的耐药酶。考虑到其他类型的碳青霉烯酶未检出，我们推测AmpC酶的产生与过表达和/或CTX-M 型ESBL的流行与外排泵的过表达及外膜通透性的降低等联合作用在CNSKP的耐药中也起着一定的作用。

和以往的报道一致[12]，blaCTX-M是最为流行的blaESBL，blaCTX-M-14是最主要的blaCTX-M，在亚洲国家的流行较为普遍。值得注意的是，我们检出1株携带blaCTX-M-113的细菌和2株携带blaCTX-M-142的细菌。其中，blaCTX-M-142虽然在中国分离的大肠埃希菌中被报道[15],但这是我们首次在肺炎克雷伯菌中检出该基因；到目前为止，blaCTX-M-113目前尚未在临床菌株中检测到。我们发现，blaCTXM-14在CNSKP组的分布中显著高于CSKP组，这可能是由于blaCTX-M-14大多与blaKPC-2位于同一移动元件上在细菌间播散而引起的。PMQR中，以oqxAB和qnrB的流行最为广泛，其中qnrB10是qnrB主要的变异体，该基因已在大肠埃希菌、沙门菌属及肺炎克雷伯菌种被发现[16，17]。本研究中，50%的qnrB为qnrB10，表明qnrB10有潜在流行的趋势，需加强监测。此外，我们也首次在肺炎克雷伯菌中检出了qnrB60，到目前为止，该基因只在一株弗劳地柠檬酸杆菌中被检测到[18]。此外，我们以往的研究发现，oqxAB在产KPC-2肺炎克雷伯菌株中高度流行[12]，而本研究中，我们发现，oqxAB在CSKP组中的分布高于CNSKP组，明显不同于以往的报道，具体的原因尚不清楚。armA和rmtB是本研究中流行的16SRMTase酶编码基因，这与以往的的报道一致[11]。此外，rmtB的流行伴随着blaKPC-2的播散，这与我们以往的研究结果一致[12]，同时表明rmtB主要流行于CNSKP菌株，再次肯定了他们之间的相关性。

总之，CNSKP菌株的耐药率显著高于CSKP组，blaCTX-M、blaTEM、rmtB主要流行于CNSKP组，这可能与抗生素选择压力下遗传元件的播散有关，需加强院内感染控制，以减缓耐药发展。

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